左归丸、右归丸对肾虚质大鼠海马MEK表达的影响

肾虚质是常见的中医体质类型之一，是以肾的脏腑功能低下为主要特征的一种体质状态，又可分为肾阴虚、肾阳虚、肾气虚、肾精虚等[1]。早在秦汉时期，医家就已经发现肾与学习记忆的关系。《黄帝内经》总结道“肾藏精舍志，主骨、生髓、通脑。”明确指出脑与肾密切的相对应关系；《灵枢调经论》曰：“血并于上，气并于下，乱而善忘”；陈士铎曰：“补脑必须添精，而添精必须滋肾”《医林改错》曰：“年高肾亏，髓海空虚，发为呆病”“小儿无记忆者，脑髓未满；年高无记忆者，脑髓渐空”，肾虚髓空是学习记忆减退的重要病机[2]，故补肾填精髓是其基本治则。汪昂说：“人之精与志皆藏于肾，肾精不足则志气不能上通于心，故迷惑善忘也”，提出了记忆与肾精的互化关系。李伟茜等[3]认为灵机记忆皆出于脑，脑为髓海，精髓是脑生理活动的物质基础。任晨斌等[4]认为补肾填精髓是治疗记忆衰退的基本治则。王建伟等[5]认为治疗记忆衰退类疾病应益肾化浊，除邪同时重点补肾生髓。历代医家无论从理论探讨，还是临床实践方面，均认为肾虚的一个重要表现是学习记忆能力的下降，且现代实验研究发现，海马体(海马回)具有对大脑学习记忆所要求的信息获取有关的重要脑区功能，对记忆的形成及定向功能有明确作用[6]。马书娟等[7]、康湘萍等[8]认为补血方药可以通过降低海马神经细胞凋亡，进而改善海马功能，提高学习记忆能力。探讨补肾药物对海马区MEK表达的影响，对于认识与预防因肾虚而至记忆衰退及老年痴呆具有重要的理论价值和现实意义[9]。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康12周龄SD大鼠合笼随即交配子代鼠，雌雄按1∶1比例共40只，体重260～280 g，西安交通大学医学部实验动物中心提供，合格证号：SCXK(陕)2012-003。标准饲料喂养，不限其饮食饮水，在室温22～26 ℃，相对湿度50%～70%环境下饲养。

1.2 动物造模 将购回的大鼠雌、雄分别饲养，适应性喂养1周后，按雌、雄1∶1的比例随机分组并合笼。其中，空白组4只，模型组12只。两组大鼠雌、雄合笼5 d，各雌鼠成功受孕后，将两组大鼠雌、雄分别饲养。自此对模型组孕鼠进行恐吓直至其产子。具体方法为：每日08：30～20：30，将模型组孕鼠放置在土猫活动范围之内，土猫可在鼠笼上自由活动，孕鼠可视及土猫形态，闻及土猫叫声，嗅及土猫气味，以此对孕鼠进行恐吓。空白组孕鼠不做任何处理，自由饮食饮水，至其自然生产。不对其恐吓时，将两组孕鼠置于同处，以确保非处理因素的一致性。

1.3 子代鼠分组 从空白对照组母鼠所产仔鼠中随机选出10只，作为空白对照组，不做任何处理，自由饮食饮水。模型组孕鼠产子后，仔鼠随母鼠饲养28 d，其间停止对其恐吓，以防仔鼠夭折。28 d后，将模型组母鼠所产仔鼠放置一处，随机选出30只分为3组，每组10只，分别为左归丸组、右归丸组、肾虚质模型组。依照前法，每日08：30～20：30对左归丸组、右归丸组、肾虚质模型组进行恐吓，连续1个月。其余时间将4组子代鼠置于同处，以确保其他非处理因素一致。

1.4 实验药物

1.4.1 药物组成 左归丸组方：熟地、山萸肉、炒山药、枸杞子、菟丝子、川牛膝、鹿角胶、龟板胶。右归丸组方：熟地、炒山药、枸杞子、肉桂、山萸肉、鹿角胶、当归、菟丝子、炒杜仲、制附子。生理盐水自行配制。

1.4.2 药物制备 两方均按原方药量配制，中药饮片均购自陕西中医药大学校医院中药房，将药材浸泡于6倍药材量的冷水中15 min，先用武火煎至水沸，后改用文火煎煮40 min，滤出药液后加入适量冷水，仍由武火煎至水沸，后改用文火煎30 min，滤出药液，两煎合并，右归丸浓缩药汁至150 mL，左归丸浓缩药汁至130 mL，待药液冷却后，装瓶封存，-20℃冻存备用。生理盐水：用精密天平称取0.9 g氯化钠加入50 mL蒸馏水中混匀，定容至100 mL，制备成0.9%氯化钠溶液，贮存备用。

1.4.3 给药剂量 在对子代鼠进行恐吓的同时，空白对照组和肾虚质模型组均给予生理盐水灌胃。中药组分别给予左归丸、右归丸浓缩液灌胃。根据人与大鼠剂量转换公式计算大鼠的等效计量是人的6.3倍。即子代鼠灌胃右归丸1.575 g/100 (g·d)，左归丸1.323 g/100(g·d)。

1.5 实验试剂 MEK(Elisa)试剂盒由艾来萨生物科技有限公司生产；总蛋白提取试剂盒由西安赫德生物有限公司生产；BCA蛋白定量试剂盒由西安赫德生物有限公司生产。

1.6 仪器及耗材 移液器由德国艾本德公司生产；离心管由方科医疗器械有限公司生产；锡箔纸由雷东日用品厂生产；液氮由西安赫德生物有限公司生产；制冰机(型号CL-300W)由上海芩隆奥利斯公司生产；高速组织匀浆机由艾卡仪器设备有限公司生产；低温离心机由恒诺仪器设备有限公司生产；生化恒温孵育箱由恩培仪器制造有限公司生产；全自动酶标仪(型号DNM-9606)由普朗公司产生。

1.7 溶液配制 7%水合氯醛溶液：用精密天平称取7 g水合氯醛加入50 mL蒸馏水中混匀，定容至100 mL。0.9%氯化钠溶液：用精密天平称取9 g氯化钠加入500 mL蒸馏水中混匀，定容至1 000 mL。

1.8 实验动物组织取材 取材前对实验动物禁食12 h，以确保麻醉药量的准确性，避免取材过程中动物排泄物污染组织及操作台。各组中随机取出雌雄各10只，逐个称重、标记，根据其体重，按照每0.5 mL/100 g体重的药量，腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后，快速断头取脑，将脑组织包入标记好的锡箔纸中，迅速投入液氮盒内。取材完毕后，用长镊子将所有组织从液氮盒内取出，贮存于-80 ℃冰箱中备用，取组织时应做好防护措施，避免冻伤。

1.9 操作步骤

1.9.1 提蛋白 将脑组织从-80 ℃冰箱中取出，用精密天平称取100 mg，用组织剪将称取的组织剪成细小的碎片，放入4 mL 离心管中，以每20 mg组织加入200 μL 裂解液的比例，在4 mL离心管中加入裂解液，用手持式匀浆机匀浆，匀浆4～6次，每次10 s，匀浆时上下提插，但要保证匀浆机转头在液面以下，直至无肉眼可见残渣；将无泡沫层的组织混悬液转移至1.5 mL 离心管中，冰上孵育30 min，其间每10 min震荡混匀1次；离心机4 ℃预冷30 min后，将组织混悬液置于实验设计低温离心机中，温度4 ℃，14 000 r/min，离心10 min，收取上清液按实验设计分装完好，置于-80 ℃冰箱环境保存。为避免蛋白快速降解，以上所有操作均在冰上进行。

1.9.2 BCA蛋白定量 所有试剂室温放置20 min。准备好BCA工作液，每孔中200 μL BCA工作液，根据样本数及标准孔数目计算所需要的BCA工作液的总体积；然后将50份A液加入1份B液混合后得到工作液(若看见浑浊，轻度晃动可消失)。取10 μL浓度为5 mg/mL的BSA标准品，用蒸馏水稀释至100 μL，使其最终浓度为0.5 mg/mL。在96孔板中分别加入0 μL、1 μL、2 μL、4 μL、8 μL、16 μL、20 μL浓度为0.5 mg/mL的标准品，加蒸馏水将溶液补至20 μL。在96孔板中加入20 μL已被稀释20倍的样品；标准品孔和样品孔各加入200 μL BCA工作液，放生化培养箱37 ℃孵育30 min。使用酶标仪在562 nm处测其吸光度值，绘制标准曲线，测出浓度。用超纯水调定蛋白浓度，蛋白样品最终浓度为0.85 μg/μL。

1.9.3 酶联免疫吸附测定MEK浓度 所有试剂室温放置20 min，从铝箔袋中取出需要的酶标板板条，根据需要量配置洗涤液；在纸上布板，确定好标准孔和样品孔的位置；依据布板顺序，在酶标板标准品孔中各加不同浓度(S0-S5)的标准品50 μL；样品孔中加入10 μL样品，再用样品稀释液定容至50 μL；空白孔不需要加；每孔各中加入100 μL用辣根过氧化酶标记过的检测抗体，用封板膜封住，防止污染，放置生化培养箱中37 ℃孵育60 min。倒掉板中液体，在吸水纸上拍干，每孔中加入400 μL的洗涤液，静置1 min后倒掉洗涤液，再拍干，重复洗5次。每孔中加入A、B两种底物各50 μL，用封板膜封住，再用铝箔纸包好，避光，放置生化培养箱中37 ℃孵育15 min。最后，每孔中各加入50 μL的终止液，终止反应，用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的吸光度值(从孵育结束到开始读板要在15 min内完成)，绘制标准曲线，计算浓度。

2 结 果

2.1 各组仔鼠一般情况观察 肾虚质模型组较其他各组出现情绪低沉、懒散萎靡、食量降低、体重偏轻、生长发育迟缓、毛发稀疏松弛、大便质软或不成形、小便频多等一系列符合中医肾虚体质临床特点的现象。

2.2 各组海马MEK蛋白表达比较 与空白对照组比较，肾虚质模型组MEK蛋白含量降低(P<0.01)，与肾虚质模型组比较，左归丸组、右归丸组MEK蛋白含量明显升高(P<0.05)，左归丸组和右归丸组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

组别只数MEK空白对照组1064.112±7.7652)肾虚质模型组1050.500±6.408 左归丸组1056.517±7.7911)右归丸组1055.427±4.5631)

与肾虚质模型组比较，1)P<0.05，2)P<0.01

3 讨 论

记忆力减退属中医学“善忘”“健忘”“喜忘”等范畴，其病位在脑[10]。肾精，是对肾收藏的精微物质的总称。从经络学说来看，足太阳膀胱经“从巅入脑”，肾与脑通过经络相连，并在功能上相互协作，密不可分。脑为髓海，肾为精之府，精水充足则化髓，脑髓足，则神充；反之，肾水匮乏，脑失所养，则神衰健忘[11]。且肾中所藏之精在内为人体生骨、化髓、充脑，在外表现为志、作强、主伎巧的功能[12]。而志的主要含义之一就是记忆[13]。

因为补肾中药对脑有很好的保护作用[14]，并可以通过调控某些基因的表达来发挥改善肾虚质的作用[15]。有实验研究发现，用补肾药治疗肾虚并发脑缺血动物后，记忆力显著提高[16]。刘书考[17]研究发现，补肾方药可通过下调环磷腺苷效应元件结合蛋白的含量，抑制长时程记忆的形成。本实验选取常用药物左归丸、右归丸进行治疗观察，左归丸为壮水之剂，滋肾补阴，临床用于治疗真阴不足者，表现多为腰酸膝软，盗汗，神疲口燥；右归丸为益火之剂，温补肾阳，填精止遗，临床用于治疗肾阳不足，命门火衰者，表现多为腰膝酸冷，怯寒畏冷，阳痿遗精，精神不振。肾虚体质主要表现为肾精亏虚，肾精所产生的生理效应有肾阴、肾阳两方面，故本实验设有左归丸、右归丸两个组别分别进行研究。

本实验采用“猫吓鼠”经典方法造模[18]，观察各组仔鼠一般情况发现，肾虚质模型组较其他各组出现情绪低沉、懒散萎靡、食量降低[19]、体重偏轻、生长发育迟缓、毛发稀疏松弛、大便质软或不成形、小便频多等一系列符合中医肾虚体质临床特点的现象[20]，且通过断头取脑及酶联免疫吸附实验法发现肾虚质大鼠MEK表达明显低于左归丸组、右归丸组与空白对照组，说明肾虚质记忆学习能力与MEK表达有密切关系。肾虚模型大鼠经过左归丸、右归丸治疗后，MEK表达明显上升，但左归丸组与右归丸组比较治疗MEK蛋白差异不明显，说明补肾方剂可以上调肾虚质大鼠海马MEK蛋白异常表达，也证明补肾药物可以通过上调中枢神经系统中的MEK表达，改善大鼠学习记忆能力。