姜黄素对淀粉样前体蛋白/早衰素1双转基因小鼠学习记忆能力及Wnt信号通路相关蛋白表达的影响

宋晓环 姚晓媛 王忠超 胡金秋 朱莉

(长春医学高等专科学校病理教研室，吉林 长春 130031)

阿尔茨海默病(AD)是从阶段性记忆障碍到全面性认知障碍的一种神经变性疾病，同时也是一种与年龄相关的神经系统原发性退行性病变，多在中老年人发病，因此又称为老年性痴呆〔1～3〕。目前对AD的延缓和控制尚无理想方案。研究表明〔4,5〕，姜黄素对β样淀粉蛋白(Aβ)的神经毒性作用已得到证实，因此姜黄素对AD的潜在治疗作用日益受到关注，其作用机制研究成为研究热点。本实验拟分析姜黄素如何调节Wnt信号通路相关蛋白β-连环蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶(GSK)-3β和海马区记忆蛋白海马区突触前蛋白(Synapsin)1、海马区突触后蛋白(PSD)-95的阳性表达强度及mRNA水平，从而达到提高AD小鼠的学习记忆能力以发挥防治AD的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物和分组 实验动物来源于辽宁长生生物技术股份有限公司，选取双转基因雄性淀粉样前体蛋白(APP)/早老素(PS)1小鼠30只，体质量(24.2±1.4)g，随机分为模型组、盐酸多奈哌齐组和姜黄素组，每组10只；用同月龄、同体系野生雄性C57BL/6小鼠10只作为空白对照组，体质量(23.8±1.3)g；4组均给予正常饮食。

1.2实验主要仪器设备 Morris水迷宫(Panlab公司，西班牙)；Leica2245切片机(Leica公司，德国)；OLYMPUS BX51光学显微镜(OLYMPUS公司，日本)；ABI7300实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪(Biotek公司，美国)；Biometra PCR扩增仪(Biotek公司，美国)。

1.3实验主要试剂 姜黄素由上海远慕生物科技公司提供；盐酸多奈哌齐由安理申卫材药业有限公司提供(国药准字H20070181)；鼠抗β-catenin和GSK-3β抗体购于Abcam公司；鼠抗海马区Synapsin1、海马区PSD-95抗体购于武汉三鹰公司；SP9710和二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购于福州迈新生物技术有限公司； Trizol购于Invitrogen公司；Taq酶、DL2000 marker和实时荧光定量(RT)-PCR反转录试剂盒购于塔克拉公司；引物由上海生物工程有限公司提供。

1.4给药方法 4组给药方式均为灌胃，空白对照组和模型组每天一次给予生理盐水(0.1 ml/10 g)、盐酸多奈哌齐组每天一次给予盐酸多奈哌齐(3.25 mg/kg)、姜黄素组每天一次给予姜黄素(50 mg/kg)，给药时间为8 w。

1.5各组学习记忆能力 进行Morris水迷宫试验〔6〕，在实验结束前5 d，水迷宫连续训练4 d，第5天测试小鼠逃避潜伏期、经过平台次数和平台象限停留时间。

1.6各组甲醛溶液脑组织海马区神经细胞的损伤程度 治疗8 w结束后，处死小鼠并取脑组织海马区，放入甲醛溶液固定后常规脱水、透明、浸蜡和包埋，制备5 μm切片进行苏木精-伊红(HE)染色，通过OLYMPUS BX51光学显微镜下观察脑组织海马区神经细胞损伤程度。

1.7免疫组织化学染色检测各组脑组织海马区β-catenin、GSK-3β、Synapsin1及PSD-95的蛋白阳性表达 制备3 μm石蜡切片4张，分别进行4种抗体的免疫组织化学染色(SP法)，观察β-catenin、GSK-3β、Synapsin1及PSD-95的蛋白阳性表达强度，阳性表达呈棕黄色、细胞核用苏木精复染为蓝色。通过Motic Images Advanced3.2图像分析软件半定量分析蛋白阳性表达强度，分析结果以光密度值(OD值)表示，OD值越大阳性表达越强。

1.8RT-PCR检测各组脑组织海马区β-catenin、GSK-3β、Synapsin1及PSD-95的mRNA水平 用Trizol提取脑组织海马区总RNA，所有样本基因扩增3次，行RT-PCR检测β-catenin、GSK-3β、Synapsin1及PSD-95的mRNA水平，取Ct值均值，采用2-ΔΔCt表示目的基因相对表达水平。

1.9统计学分析 采用SPSS18.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组Morris水迷宫逃避潜伏期、经过平台次数和平台象限停留时间 与空白对照组比较，模型组逃避潜伏期明显延长、经过平台次数明显减少、平台象限停留时间明显缩短(P<0.05)；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组和姜黄素组逃避潜伏期明显缩短、经过平台次数明显增加、平台象限停留时间明显延长(P<0.05)；盐酸多奈哌齐组和姜黄素组各指标差异无统计学意义(P>0.05)；见表1。

表1 各组Morris水迷宫逃避潜伏期、经过平台次数和平台象限停留时间的比较

与空白对照组比较：1)P<0.05;与模型组比较：2)P<0.05；下表同

2.2各组脑组织海马区神经细胞损伤程度 形态学观察，空白对照组海马区神经细胞排列整齐、紧密、多层规则、细胞核大核仁清晰；模型组海马区神经细胞排列松散、层数减少、不规则、细胞核固缩、体积减小、细胞周隙明显；盐酸多奈哌齐组和姜黄素组海马区神经细胞较模型组明显数量增多、体积增大、细胞周隙缩小、细胞固缩坏死减少。见图1。

2.3各组脑组织海马区β-catenin、GSK-3β、Synapsin1及PSD-95的蛋白阳性表达和mRNA水平 与空白对照组比较，模型组Wnt信号通路相关蛋白(β-catenin、GSK-3β)和海马区与记忆相关的蛋白(Synapsin1、PSD-95)的阳性表达强度和mRNA水平明显降低(P<0.05)， 盐酸多奈哌齐组和姜黄素组β-catenin、GSK-3β和海马区Synapsin1、PSD-95蛋白的阳性表达强度和mRNA水平亦显著降低(P<0.05)；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组和姜黄素组β-catenin、GSK-3β和海马区Synapsin1、PSD-95蛋白的阳性表达强度和mRNA水平明显升高(P<0.05)；盐酸多奈哌齐组和姜黄素组各指标差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

组别β-catenin蛋白GSK-3β蛋白Synapsin1蛋白PSD-95蛋白 β-catenin mRNAGSK-3β mRNASynapsin1 mRNAPSD-95 mRNA空白对照组 6.42±0.57 6.91±0.766.12±0.536.04±0.31 1.69±0.15 1.85±0.261.49±0.121.16±0.05模型组 1.19±0.151)1.24±0.381)1.17±0.421)0.98±0.161) 0.37±0.061)0.52±0.051)0.31±0.051)0.22±0.031)盐酸多奈哌齐组4.05±0.211)2)4.36±0.411)2) 3.97±0.351)2)3.82±0.341)2)1.12±0.111)2)1.24±0.181)2) 1.07±0.091)2)0.81±0.071)2)姜黄素组4.18±0.391)2)4.29±0.521)2) 4.01±0.481)2)3.91±0.271)2)1.18±0.091)2)1.29±0.131)2) 1.15±0.081)2)0.86±0.041)2)

3 讨 论

AD是老年痴呆的常见类型，目前其发病机制尚不清楚，其发病率和死亡率随着社会人口老龄化、生活压力的增加而逐年升高〔7～9〕。

姜黄素是从草本植物姜黄根茎中提取出的一种多酚类化合物，以往研究表明姜黄素具有较好的生理活性，能够清除自由基、降血脂、抗炎、抗肿瘤及抑制Aβ的神经毒性作用，其在痴呆领域里应用有着潜在的防治意义〔10，11〕。AD与Wnt信号分子有着密切的联系，Wnt信号通路相关蛋白可以通过自分泌或旁分泌的方式作用于神经细胞膜，从而激活细胞内信号传导通路，调节靶基因活动〔12〕。Wnt信号通路是生物进化过程中高度保守的信号通路，也是人体发育过程重要的信号通路之一，如果Wnt信号通路中的相关蛋白发生突变，将会导致各种疾病的发生，其对神经系统的发生发展尤为重要〔13～15〕。Wnt信号通路相关蛋白β-catenin和GSK-3β能调控海马区记忆蛋白海马区Synapsin1和PSD-95，AD小鼠β-catenin、GSK-3β的下调能诱导记忆蛋白Synapsin1、PSD-95的下调〔16～18〕。

综上，姜黄素与盐酸多奈哌齐有同样的治疗效果，能显著提高AD小鼠空间学习记忆能力；其可通过上调β-catenin、GSK-3β和记忆蛋白Synapsin1、PSD-95的蛋白阳性表达强度及mRNA水平，提高AD小鼠的学习记忆能力以发挥防治AD的作用。