糖蛋白基因表达对人永生化角质形成细胞株活性的影响及机制

王丽昆 岳海龙 孙小强 刘阳 姜峰 毕庭民 刘燕 何艳舫

(1华北理工大学附属医院皮肤科，河北 唐山 063000；2开滦总医院麻醉科；华北理工大学 3机能实验室；4附属医院妇产科)

糖蛋白(GP)130基因表达于树突细胞、单核细胞等多种细胞中〔1〕，由细胞因子、免疫球蛋白氧结构域及3个纤连蛋白功能域组成，各结构域和功能域在信号传导中均发挥重要作用〔2〕。白细胞介素(IL)-6可由上皮细胞及T细胞分泌，在银屑病患者皮损组织和血清中的含量明显高于正常皮肤组织，能够调控细胞增殖、凋亡，促进表皮内T细胞聚集，诱发银屑病皮损〔3〕。Janus激酶(JAK)-信号转导与转录激活子(STAT)3信号通路是IL-6转录后发挥调控作用的主要途径，而GP130基因是沟通二者的重要桥梁，同时也与银屑病的发生、发展密切相关〔4〕。本实验在体外培养HaCaT人永生化表皮细胞，特异性降低GP130基因表达，观察对细胞增殖和IL-6 mRNA和蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1主要材料与试剂 HaCaT人永生化表皮细胞购于南京科佰生物科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(0.25%)购于北京睿嘉生物科技有限公司；GP130、IL-6、β-actin引物由南京科佰生物科技有限公司合成；兔GP130、IL-6、β-actin多克隆抗体及羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G抗体购于上海信裕生物科技有限公司。

1.2siRNA制备与分组 由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成3组GP130 siRNA序列、阴性序列，依次分为siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA-nc，并设立空白对照组。

1.3细胞培养与转染 HaCaT细胞以DMEM常规培养，每48 h换液1次，观察细胞融合80%以上时传代，取对数期细胞进行实验。细胞按5×105个/ml的密度接种于6孔板中，常规培养过夜，观察细胞融合70%～90%时进行转染；根据说明书中siRNA的浓度范围(50～200 pmol/L)每组选择80、120、150 pmol/L三个浓度进行优化，选取最佳siRNA组别和浓度进行后续实验。

1.4细胞增殖检测 采用噻唑蓝(MTT)法，细胞以5×103个/ml的密度接种于96孔板，常规培养过夜，观察细胞融合70%～90%时，使用siRNA1、siRNA-nc转染细胞，并设空白对照，转染24 h、48 h时加入5 g/L的MTT 20 μl/孔，培养4 h后弃去培养液，加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl/孔，振荡混匀，490 nm处读取各孔吸光度值。

1.5细胞周期检测 使用流式细胞仪检测，收集siRNA1、siRNA-nc、空白对照组细胞，离心后弃上清，加入70%乙醇1 ml，混匀后-20℃静置过夜；离心后弃上清，磷酸盐缓冲液洗去细胞残留乙醇，磷酸盐缓冲液0.5 ml重悬细胞，滴加DNA提取缓冲液，室温下放置5 min，离心后弃上清。滴加DNA染色液0.5 ml，室温下避光静置30 min，上流式细胞仪分析。

1.6实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测 Trizol法提取细胞总RNA，紫外分光光度法定量，各取总RNA 1 μg行逆转录，取产物2 μg进行PCR，GP130上游引物：5′-AACTCTTCTGAACCTGACTG-3′，下游引物：5′-TCTACCGCCACTACCATA-3′，扩增条带109 bp；IL-6上游引物：5′-GAACAAGGAGTGATGAGAGT-3′，下游引物：5′-GTTGAGTAGAGTA AGACG C-3′，扩增条带190 bp；β-actin上游引物：5′-GAAACGCCTACAGGTGCAGT-3′，下游引物：5′-GGAGCGACAGGTGGAAGGTC-3′，扩增条带207 bp。反应条件：95℃ 5 min、95℃ 15 s、60℃ 40 s，共40个循环，扩增产物行溶解曲线分析，2-△△Ct法测定结果。mRNA抑制率表示各浓度siRNA的沉默效果。

1.7Western印迹检测蛋白水平 放射免疫沉淀(RIPA)裂解液裂解siRNA1、siRNA-nc、空白对照组细胞，二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量，上样量50 μg，GP130蛋白进行8%分离胶十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电脉(PAGE)，IL-6蛋白进行12%分离胶SDS-PAGE，湿法转膜，封闭2 h，一抗(1∶500)4℃孵育过夜，二抗(1∶3 000)37℃孵育2 h，洗膜后暗室曝光，凝胶成像系统观察，蛋白表达水平使用目标条带与对应β-actin条带灰度值的比值表示。

1.8统计学分析 使用SPSS24.0软件进行t、F检验。

2 结 果

2.1siRNA对GP130基因的抑制效率 120 pmol/L的siRNA1序列对GP130基因沉默效果最明显，基因表达水平最低，抑制率最高。提示成功筛选出了沉默GP130基因表达的siRNA序列，选取120 pmol/L的siRNA备用。见表1。

表1 不同浓度和序列的siRNA对GP130基因表达的沉默效果

2.2120 pmol/L siRNA1沉默GP130基因效果验证 转染HaCaT细胞48 h时提取蛋白，120 pmol/L siRNA1序列可下调GP130蛋白表达水平至1.83±0.28，明显低于阴性对照组、空白对照组的4.91±0.54、4.78±0.40(P<0.05)。见图1。

图1 120 pmol/L siRNA1对GP130蛋白表达的影响

2.3沉默GP130基因对细胞增殖的影响 培养24 h时siRNA1组、siRNA-nc组、空白对照组HaCaT细胞吸光度值分别为0.18±0.03、0.20±0.05、0.21±0.07，三组HaCaT细胞增殖率之间差异无统计学意义(P>0.05)；培养48 h时HaCaT细胞吸光度值分别为0.28±0.07、0.46±0.12、0.50±0.10，siRNA1组HaCaT细胞增殖率明显低于siRNA-nc组、空白对照组(P<0.05)。

2.4沉默GP130基因对细胞周期的影响 培养24 h时G1期、S期、G2期的HaCaT细胞水平在siRNA1组、siRNA-nc组、空白对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)；培养48 h时siRNA1组G1期HaCaT细胞数量明显高于siRNA-nc组、空白对照组，S期和G2期细胞数量明显低于siRNA-nc组、空白对照组(P<0.01)；培养48 h时siRNA1组G1期细胞数量明显高于培养24 h时，G2期细胞数量明显低于培养24 h时(P<0.01)。见表2。

表2 沉默GP130基因对细胞周期的影响

与培养24 h时相比：1)P<0.05；表3同

2.5沉默GP130基因对细胞IL-6 mRNA和蛋白表达的影响 培养24 h时siRNA1组、siRNA-nc组、空白对照组IL-6 mRNA及蛋白表达水平之间差异无统计学意义(P>0.05)；培养48 h时siRNA1组IL-6 mRNA及蛋白表达水平明显低于siRNA-nc组、空白对照组(P<0.01)；培养48 h时siRNA1组IL-6 mRNA及蛋白表达水平明显低于培养24 h时(P<0.05)。见表3。

表3 沉默GP130基因对细胞IL-6 mRNA和蛋白表达水平的影响

3 讨 论

银屑病患者皮损组织中高水平的IL-6与病情严重程度密切相关〔5〕； IL-6可与GP130结合形成复合物，激活JAK-STAT3信号通路，调控下游靶基因表达，在调控细胞增殖、凋亡的同时还能够促进表皮内T细胞聚集，诱发银屑病皮损〔6〕。本实验结果显示，浓度为120 pmol/L的siRNA1序列沉默GP130基因表达的效果最明显。

本文结果提示，GP130基因低表达可能通过抑制细胞蛋白质的合成来降低HaCaT细胞增殖速率；也可能与转染48 h时IL-6合成下降，间接影响HaCaT细胞增殖有关。GP130与IL-6结合后可经JAK-STAT3信号通路调控细胞增殖。本研究结果显示，转染24 h时，沉默GP130基因尚未影响GP130蛋白合成。GP130基因介导的信号传导通路可能调控HaCaT细胞中IL-6表达水平，且该调控作用发生在转录后水平，影响HaCaT细胞周期，抑制细胞增殖。