华蟾毒精对人结直肠癌SW-480、HT-29、HCT-116细胞的放疗增敏作用

2019-11-07 03:15曹勤洪吴震峰吴晓宇陈彻姚学权刘福坤陈玉根
中国肿瘤外科杂志 2019年5期
关键词:细胞周期X射线差异

曹勤洪, 吴震峰, 吴晓宇, 陈彻, 姚学权, 刘福坤, 陈玉根

新辅助放化疗联合手术切除的治疗方案能显著改善局部进展期直肠癌患者的局部复发和总体生存[1-2]。但由于新辅助放化疗反应的个体差异,并不是所有的直肠癌患者都能从新辅助放化疗中获益。肿瘤对放疗耐受的机制非常复杂,临床通过改进放疗方案、调节免疫炎症反应和联合其他治疗等方法以减少肿瘤对放疗的抵抗[3]。

直肠癌中,目前广泛应用的放疗增敏剂为5-FU类化疗药,但其存在一定毒副作用,且疗效有限[2]。研究显示多种中药有提高放疗敏感性的作用[4-5]。华蟾毒精为中华大蟾蜍皮的有效中药单体提取物,可抑制多种肿瘤细胞生长[6-7]。华蟾素是中华大蟾蜍的初提物,研究发现对肝癌细胞具有放疗增敏作用[8]。华蟾毒精对于直肠癌的放射治疗增敏作用,鲜有报道。本研究选用人结直肠癌细胞系SW-480、HT-29、HCT-116为研究对象,采用CCK8检测细胞增殖,并用流式细胞仪测定细胞周期和凋亡变化,研究华蟾毒精在人结直肠细胞放疗中的增敏作用。

1 材料与方法

1.1 材料及设备 SW-480、HT-29、HCT-116细胞株购于上海中国科学院细胞库;DMEM培养基(批号:AB10104399)购于美国Hyclone公司;华蟾毒精(批号:Z01D7X25885)购于源叶生物;CCK8(批号:EG20161117)购于南京恩晶生物公司;碘化丙啶(批号:BKCA08)购于南京拜睿生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(批号:KGA108)购于南京凯基生物科技发展有限公司;XD-101型CO2培养箱购于日本Sanyo公司;IX51型生物倒置显微镜购于日本Olympus公司;RT-6000型酶标仪购于丹麦Radiometer公司;SPECTRA max Plus 384型酶标仪购于美国Molecular Devices公司;FACS Calibur型流式细胞仪购于美国Becton-Dickinson;RS2000Pro型生物辐照仪购于美国Radsource公司。

1.2 细胞培养及分组处理 人结直肠癌SW-480、HT-29、HCT-116细胞常规培养于DMEM培养基中,于37 ℃、5% CO2的条件下培养细胞,调整细胞状态达到对数生长期。分为正常对照组、X射线辐射组(16 Gy)、华蟾毒精组(华蟾毒精:100 ng/ml)及华蟾毒精和X射线辐射联合组(华蟾毒精100 ng/ml处理4 h后,X射线16 Gy辐照30 min)。

1.3 CCK8检测细胞增殖 取对数生长期细胞,37 ℃,0.25%胰酶(含EDTA)消化细胞2 min;收集细胞,1 000 rpm离心5 min;离心后弃上层培养液,加入4 ml新鲜培基,吹打混匀;取细胞悬液20 μl,加20 μl台盼蓝溶液,细胞计数,细胞存活率需在90%以上;显微镜计数,调整细胞浓度为4 000个/100 μl;取96孔板,密度为4 000/孔;置细胞培养箱,37 ℃,5%CO2培养过夜(16~24 h)。各组细胞在上述处理后24 h、48 h、72 h取出96孔板,弃去细胞上层培基,每孔加入100 μl 含0.5%FBS的新鲜培养基,再每孔加入10 μl CCK8,37 ℃孵育4 h。将96孔板放入酶标仪,450 nm进行读数。结果以细胞存活率表示表示。细胞存活率=(实验吸光度-空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)×100%。

1.4 Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡 各组细胞处理48 h,取出6孔板,把细胞培养液吸出至离心管内,PBS 洗涤贴壁细胞1次,加入适量胰酶细胞消化后收集细胞。用 PBS 轻轻重悬细胞并计数。取1×105个重悬的细胞,用PBS洗涤2次后加入 500 μl平衡缓冲液,加入5 μl Annexin V-FITC混匀后,加入5 μl碘化丙啶,轻轻混匀。室温(20~25℃)避光孵育15 min。进行流式细胞仪检测,Annexin V-FITC为绿色荧光,PI 为红色荧光。FITC的绿色荧光激发波长为 488 nm,在 FL1 通道检测;PI 的红色荧光在 FL2 通道检测。用 Cell Quest 等软件进行分析,绘制双色散点图,FL1 为横坐标,FL2 为纵坐标。每个样采集 10 000个信号。

1.5 流式细胞检测细胞周期 收集细胞悬液到离心管内,4 ℃,1 000 g离心后用预冷至4 ℃的PBS重悬洗涤3次,加入 1 ml预冷75%乙醇,4 ℃固定过夜。每个待检细胞样品中加入500 μl配制好的PI染色工作液,轻轻重悬细胞沉淀,置于37 ℃避光水浴。用流式细胞仪在激发波长488 nm波长处检测红色荧光,同时检测光散射情况。软件分析细胞周期相关数据。

2 结果

2.1 华蟾毒精、X射线及华蟾毒精和X射线联合应用对SW-480、HT-29、HCT-116细胞存活率的影响

如图1所示,与对照组相比,单独X射线辐照和单独华蟾毒精给药,HT-29和HCT-116细胞的存活率均降低,差异均有统计学意义(均P<0.05),但对SW-480细胞的存活率无影响,差异均无统计学意义(均P>0.05);联合应用华蟾毒精和X射线可降低SW-480、HT-29、HCT-116这3种细胞的存活率,与对照组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05),且联合应用华蟾毒精和X射线组3种细胞存活率与单独X射线辐照组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。

图1A 华蟾毒精、X射线对SW-480、HT-29、HCT-116细胞存活率的影响1A:华蟾毒精组、 X射线组SW-480细胞存活率与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);华蟾毒精和X射线联合组中SW-480细胞存活率与对照组、X射线辐射组相比,差异均有统计学差异(P<0.05); 1B:华蟾毒精组、 X射线组及华蟾毒精和X射线联合组中HT-29细胞存活率与对照组相比,差异均有统计学差异(P<0.05);华蟾毒精和X射线联合组中HT-29细胞存活率与X射线辐射组相比,差异有统计学意义(P<0.05); 1C:华蟾毒精组、 X射线组及华蟾毒精和X射线联合组HCT-116细胞存活率与对照组相比,差异均有统计学差异(P<0.05);华蟾毒精和X射线联合组HCT-116细胞存活率与X射线辐射组相比,差异有统计学意义(P<0.05)

2.2 华蟾毒精和X射线联合应用对人结直肠SW-480、HT-29和HCT-116细胞凋亡的影响 如表1及图2所示,与对照组相比,单独华蟾毒精处理(100 ng/ml)和单独X射线(16 Gy)均能引起人结直肠SW-480、HT-29和HCT-116细胞的凋亡率升高,差异有统计学意义(均P<0.05);与单独X射线处理相比,联合应用华蟾毒精和X射线处理三种细胞凋亡率均增加,差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 华蟾毒精和X射线对SW-480、HT-29、HCT-116细胞凋亡的影响

分组凋亡率(%) SW480 对照组2.27±0.33 华蟾毒精组12.85±0.59∗ X射线组10.32±0.44∗ 华蟾毒精+X射线组15.87±0.63∗# HT-29 对照组2.65±0.32 华蟾毒精组32.38±0.77∗ X射线组6.98±0.37∗ 华蟾毒精+X射线组16.43±0.69∗# HCT-116 对照组3.14±0.28 华蟾毒精组30.1±0.55∗ X射线组4.38±0.38∗ 华蟾毒精+X射线组16.53±0.59∗#

注:*为与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);#为与X射线组相比,差异有统计学意义(P<0.05)

2.3 流式细胞仪测定细胞周期变化 见图3。细胞周期检测结果所示,与对照组相比,3种细胞株的相应处理组的细胞周期均发生了改变,但3种细胞株的变化并不相同。华蟾毒精处理组与对照组相比:SW-480细胞株G1期细胞比例未发生改变(P=0.146),见图3A-2;HT-29细胞株G1期和S期细胞比例均发生改变(G1期:P<0.001;S期:P<0.001),见图3B-2;HCT-116细胞株G1期、S期以及G2期细胞比例均发生了改变(G1期:P<0.001;S期:P<0.001;G2期:P<0.001),见图3C-2。

图2 华蟾毒精和X射线对SW-480、HT-29、HCT-116细胞凋亡的影响2A1~2A4:华蟾毒精和X射线对SW-480细胞凋亡的影响 2A-1为对照组,2A-2为华蟾毒精组,2A-3为X射线组,2A-4为华蟾毒精+X射线组;2B1~2B4:华蟾毒精和X射线对HT-29细胞凋亡的影响 2B-1为对照组,2B-2为华蟾毒精组,2B-3为X射线组,2B-4为华蟾毒精+X射线组;2C1~2C4:华蟾毒精和X射线对HCT-116细胞凋亡的影响 2C-1为对照组,2C-2为华蟾毒精组,2C-3为X射线组,2C-4为华蟾毒精+X射线组

X射线组使SW-480细胞阻滞于G1期(图3A-3),联合华蟾毒精,仍使细胞阻滞于G1期(图3A-4),差异无统计学意义(P>-0.05);X射线使HT-29细胞阻滞于G2期(图3B-3),但联合华蟾毒精后使细胞同时阻滞于G1期和G2期(图3B-4),差异有统计学意义(P<0.05),且S期细胞减少,差异有统计学意义(P<0.05);X射线使HCT-116细胞阻滞于G1期(图3C-3),联合华蟾毒精时仍使细胞阻滞于G1期(图3C-4),差异无统计学意义(P>0.05)。

如上所述,华蟾毒精对SW-480细胞周期影响不明显,X射线使SW-480细胞阻滞于G1期,X射线联合华蟾毒精组与X射线组的细胞周期无明显差异;华蟾毒精使HT-29细胞主要阻滞于S期,X射线使HT-29细胞阻滞于G2期,X射线联合华蟾毒精使HT-29细胞阻滞于G1期和G2期,联合组与X射线组的细胞周期相比,G1期细胞比例显著增加,而S期细胞比例明显减少;华蟾毒精使HCT-116细胞阻滞于G2期,X射线使HCT-116细胞阻滞于G1期,X射线联合华蟾毒精使HCT-116阻滞于G1期,联合组与X射线组细胞周期相比,无明显差异。

图3 华蟾毒精和X射线对SW-480、HT-29、HCT-116细胞周期的影响3A-1~3A4:华蟾毒精和X射线对SW-480细胞周期的影响3A-1为对照组;3A-2为华蟾毒精组;3A-3为X射线组;3A-4为华蟾毒精和X射线联合组。华蟾毒精组与对照组相比,G1期、S期和G2期细胞比例差异无统计学意义(G1期:P=0.146;S期:P=0.062;G2期:P=0.133);X射线组与对照组相比,G1期细胞比例,差异有统计学意义(P<0.001);华蟾毒精和X射线联合组与X射线辐射组相比,G1期细胞比例差异无统计学意义(P=0.232) 3B-1~3B-4:华蟾毒精和X射线对HT-29细胞周期的影响3B-1为对照组;3B-2为华蟾毒精组;3B-3为X射线组。3B-4为华蟾毒精和X射线联合组。华蟾毒精组与对照组相比,G1期和S期细胞比例,差异均有统计学意义(G1期:P<0.001;S期:P<0.001),而G2期细胞比例差异无统计学意义(P=0.203);X射线组与对照组相比,G2期细胞比例,差异有统计学意义(P<0.001);华蟾毒精和X射线联合组与X射线辐射组相比,G1期细胞比例差异有统计学差异(P<0.001),且S期细胞比例,差异亦有统计学差异(P<0.001) 3C-1~3C-4:华蟾毒精和X射线对HCT-116细胞周期的影响3C-1为对照组;3C-2为华蟾毒精组;3C-3为 X射线组;3C-4为华蟾毒精和X射线联合组。华蟾毒精组与对照组相比,G1期、S期以及G2期细胞比例,差异均有统计学意义(G1期:P<0.001;S期:P<0.001;G2期:P<0.001);X射线组与对照组相比,G1期细胞比例差异有统计学差异(P<0.001);华蟾毒精和X射线联合组与X射线辐射组相比,G1期细胞比例差异无统计学差异(P=0.201)

3 讨论

蟾酥是我国重要的传统中药材,临床应用广泛,可应用于止痛、强心及抗肿瘤[9]。蟾酥主要抗肿瘤活性成分为华蟾毒精[10]。华蟾毒精中成药包括胶囊剂和注射剂,在国内已单独、联合化疗或联合放疗用于多种肿瘤治疗。其单独应用于结直肠癌[11]、胃癌[12]、肝癌[8,13]体现了明显的抗癌疗效,联合放射应用于中晚期鼻咽癌[14]、食管癌[15]、肺癌[16],效果亦佳。

体外实验研究发现,华蟾毒精可以增加肝癌Bel-7402细胞的凋亡,抑制NF-κB 活化,并增强其放疗敏感性[8]。在对食管癌研究中发现,华蟾毒精能通过P73信号通路抑制细胞周期并促进细胞凋亡[17]。而P73可以被酪氨酸激酶c-Abi调节,并参与放疗相关DNA损伤引起的细胞凋亡过程[18]。Wang等[19]发现华蟾毒精可以通过ROS/MAPK信号通路诱导细胞凋亡, 而ROS/MAPK信号通路参与细胞放疗耐受的细胞内信号转导[18]。

本研究结果显示X射线、华蟾毒精能抑制HT-29及HCT-116细胞株增殖(P<0.05),但对SW-480细胞株抑制作用较弱(P>0.05),说明SW-480对华蟾毒精及X射线具有耐受性。华蟾毒精和X射线联合作用时,不仅放疗敏感细胞株(HT-29、HCT116)的增殖明显受抑制(P<0.05),而且放疗耐受的SW-480细胞株亦显示出显著的增殖抑制作用P<0.05)。而华蟾毒精和X射线联合作用时三种结直肠癌细胞的增殖均明显低于X射线组(P<0.05)。因此华蟾毒精不仅能增加放疗敏感结直肠癌细胞的放疗敏感性,并且能逆转放疗耐受结直肠癌细胞的放疗敏感性。本研究还发现,与对照组相比,华蟾毒精能增加SW-480[(12.85±0.59)比(2.27±0.33),P<0.05)]、HT-29[(32.38±0.77)比(2.65±0.32),P<0.05)]以及[HCT-116(30.1±0.55)比(3.14±0.28),P<0.05)]的细胞凋亡,因此华蟾毒精可能通过增加结直肠细胞凋亡而起到放疗增敏作用。另外,本研究发现华蟾毒精对SW-480、HT-29以及HCT-116三种细胞株的细胞周期作用并不相同,与对照组相比,华蟾毒精对SW-480的细胞周期影响不明显(P>0.05),但能使HT-29细胞阻滞于S期(P<0.05),使HCT-116阻滞于G2期(P<0.05)。如前所述,华蟾毒精对SW-480的增殖抑制作用不明显,但能增加SW-480的细胞凋亡,因此华蟾毒精可能是通过增加SW-480的细胞凋亡起到放疗增敏作用,而非通过细胞周期抑制作用。而对于HT-29以及HCT-116细胞,华蟾毒精可能同时通过增加细胞凋亡和抑制细胞周期起到放疗增敏作用。

综上,华蟾毒精能够增加人结直肠癌SW-480、HT-29及HCT-116的凋亡,并增强其放疗敏感性,可作为结直肠癌放疗的辅助治疗。

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