李会影, 徐明鑫, 徐明研
宫颈癌是女性发病率最高的恶性肿瘤之一。近年来随着我国人口老龄化进程的加剧以及生活环境、饮食习惯的转变,宫颈癌发病率和患病率逐年递增,已成为影响中老年女性人群身心健康和生活质量的主要肿瘤疾病[1]。微小RNA(miRNA)是一种内源性非编码单链小分子的RNA,其长度约为18~25个核苷酸,通过与靶信使RNA的互补配对结合,引起靶mRNA降解或翻译抑制,达到调控基因表达功能的目的。近年来针对宫颈癌与miRNA关系的研究较多。目前临床已证实人类乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌发生发展的独立高危因素,HPV16、18是常见的HPV感染类型,也是诱发宫颈癌的主要HPV类型之一,而miR-196则为人体miRNA之一,其可结合不同靶基因发挥致癌或抑癌作用[2]。在结肠癌的研究中发现,结肠癌组织中miR-196的表达明显高于正常结肠组织,因此有学者认为miR-196b的高度表达可能是评价患者预后结局的有效客观指标[3-4],而针对miR-196b与宫颈癌HPV18感染的关系目前鲜有报道。本研究选取80例宫颈癌病理标本,探讨miR-196b在宫颈癌组织中的表达情况及其与HPV18感染的关系。
1.1 一般资料
选取2016年1月至2018年1月于牡丹江医学院附属红旗医院确诊的80例宫颈癌患者,均经组织病理学检查确诊为宫颈癌。排除合并其他部位恶性肿瘤,自身免疫性疾病,精神疾病,既往有宫腔操作、手术史,接受局部或全身放化疗者。本组80例患者年龄35~74(49.5±8.7)岁,FIGO分期为Ⅰ期15例、ⅡA期16例、ⅡB期38例、Ⅲ期11例。获取80例患者的宫颈癌组织标本,同时选取其周围健康宫颈黏膜组织标本作为对照。
1.2 研究方法
1.2.1 仪器与试剂 Sanyo -80 ℃超低温冰箱、高速冷冻离心机、NanoDrop ND-1000紫外分光光度计、BioRad凝胶电泳仪、7500实时定量PCR反应仪、即用型细胞和组织总RNA提取试剂(Invitrogen Trizol)、mi-RNA 分析仪(hsa-miR-196b TaqMan MicroRNA Assays)。miR-196b引物序列为TAGGTAGTTTCCTGTTGTTGGG。
1.2.2 检测患者HPV18感染情况 采集患者宫颈分泌物,采用薄层液基细胞学技术检测患者HPV18感染情况,并据此检验结果将本组80例患者分为HPV18阳性组(n=44)与HPV18阴性组(n=36)。
1.2.3 实时定量PCR法测定标本组织中miR-196b表达情况 组织标本采集后放入液氮中储存,保存于-80 ℃超低温冰箱,先提取总RNA:应用高速匀浆机充分匀浆组织标本,加入1 ml TRIzol试剂并严格按照说明书提取总RNA,获取1 μl RNA并应用1%琼脂糖凝胶电泳处理20 min,在紫外灯下进行摄像分析,并应用分光光度计分别于260、280 nm波长处测定吸光度(A)值,为A260、A280,计算RNA含量及A260/A280比值,提取总RNA,应用DNase I去除痕量基因组DNA。
然后进行逆转录反应:严格按照逆转录试剂盒说明书操作,RNA量为500 ng,冰上加入5倍缓冲液2 μl、逆转录酶0.5 μl、5倍反转录引物2 μl、总RNA 1 μl、DEPC水至10 μl,所有试剂加入后于37 ℃反应15 min,85 ℃反应5 s,0 ℃反应5 min,最后于-20 ℃保存。
最后进行实时定量PCR测定:反应体系为2×Premix EX Taq 2 μl、2×Taqman MicroRNA Assays 1 μl、cDNA 2 μl、50×ROXⅡ0.4 μl,灭菌水添至20 μl,将反应管放置在实时定量PCR反应仪中,设定条件为95 ℃ 30 s预变性,PCR反应95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s,反应40个循环并应用荧光信号监测。
1.3 观察指标
根据miR-196b及内参U6的RNA扩张曲线获取宫颈癌Ct值,在相对定量分析中以Ct计算miR-196b的表达差异倍数。为方便统计分析,宫颈癌中T/N比值≥0.5视为miR-196b高表达,<0.5为miR-196b低表达。
1.4 统计学方法
2.1 miR-196b在宫颈癌组织中的表达及其与病理特征的关系
miR-196b在宫颈癌组织中的相对表达值为0.875±0.132,高于正常黏膜组织中的相对表达值0.514±0.294,差异有统计学意义(t=2.617,P<0.05)。在宫颈癌患者中,肿瘤分期高、存在淋巴和远处转移患者的miR-196b水平较高,差异有统计学意义(P<0.05);而不同年龄、肿瘤大小、组织分化程度、浸润深度患者的miR-196b水平差异无统计学意义(P>0.05),见表1。
2.2 宫颈癌组织中miR-196b表达与HPV18感染的关系
80例宫颈癌中miR-196b高表达61例(76.25%),低表达19例(23.75%);HPV18阳性组miR-196b高表达率高于HPV阴性组,ⅡB~Ⅲ分期的miR-196b高表达率高于Ⅰ~ⅡA分期,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。
表1 80例宫颈癌患者miR-196b表达水平与临床病理特征的关系
病理特征nmiR-196bt值P值 年龄-0.9130.335 >45岁491.412±1.032 ≤45岁312.036±1.285 肿瘤直径-0.3850.625 >4 cm321.889±1.521 ≤4 cm481.695±1.250 组织分化程度0.9750.625 高50.705±0.052 中711.792±1.317 低41.598±0.049 病理分期-2.9520.002 Ⅰ~ⅡA310.854±0.352 ⅡB~Ⅲ492.182±1.254 浸润深度-0.6200.532 T1+T2221.625±1.395 T3+T4581.795±1.523 淋巴转移-2.9570.002 有422.248±1.622 无381.003±0.892 远处转移-2.8710.005 有54.501±0.521 无751.514±0.852
表2 宫颈癌组织中miR-196b表达与HPV18感染的关系
病理参数nmiR-196b低表达高表达χ2值P值 HPV1811.9990.001 阳性444(9.1)40(90.9) 阴性3615(41.7)21(58.3) 临床分期10.9750.001 Ⅰ~ⅡA3112(38.7)19(61.3) ⅡB~Ⅲ494(8.2)45(91.8)
2.3 宫颈癌患者miR-196b表达情况与生存期关系
生存分析结果显示miR-196b高表达且HPV18阳性患者的生存期明显短于miR-196b低表达且HPV18阴性患者或单独miR-196b高表达的患者(Log-rankχ2=5.617,P=0.036),见图1。
a:miR-196b低表达且HPV18阴性;b:miR-196b高表达但HPV18阴性;c:miR-196b低表达但HPV18阳性;d:miR-196b高表达且HPV18阳性图1 宫颈癌患者生存曲线图
2.4 miR-196b表达、HPV18感染与宫颈癌患者预后的关系
采用Cox风险比例模型进行多因素分析结果显示,病理分期高、有淋巴转移、有远处转移、miR-196b高表达且HPV18阳性为宫颈癌的危险因素,见表3。
表3 miR-196b、HPV18与宫颈癌患者预后的关系
变量OR95%CIP值 年龄1.1980.814~1.7590.347 肿瘤直径1.3550.918~2.0240.125 分化程度1.3630.913~2.0110.130 病理分期2.4471.652~3.6220.001 浸润深度1.0950.772~1.6750.072 淋巴转移1.7521.157~2.6510.007 远处转移1.9511.208~2.9580.006 miR-196b高表达且HPV18阳性3.9512.571~6.0620.001
miRNA是一种长度较小的内源性非编码调控RNA,其能够通过对mRNA的特异性降解以及对蛋白翻译的抑制作用,达到调控靶基因表达的目的,其在细胞发育、增殖、分化、凋亡等生物学进程中均具有重要的地位[5]。近年来的临床研究还发现,miRNA也具有癌基因与抑癌基因的双重作用,其在肿瘤的发生、发展中具有重要的作用[6],临床在对宫颈癌的miRNA研究发现,宫颈癌病灶组织中miRNA表达存在部分异常,有学者通过对IB~ⅡA期宫颈癌组织标本进行miRNA表达谱分析,发现70个miRNA表达明显异常,其中68个miRNA表达显著上调,而miR-149、miR-203表达明显下调[7],这些均直接或间接的表明miRNA在宫颈癌的发生、发展中具有一定的影响作用[8]。
HPV感染同样是导致宫颈癌发生、发展的重要影响因素,其中HPV18型是较常见的HPV感染类型,也是导致宫颈癌发生风险最高的HPV类型之一[9],因此研究HPV18感染与miR-196b表达之间的关系,对评估宫颈癌患者病情、制定治疗方案、管理预后等方面具有重要的临床意义。本组研究结果显示,miR-196b在宫颈癌组织中的表达量明显高于正常黏膜组织,肿瘤分期高、存在淋巴和远处转移患者的miR-196b水平较高,而不同年龄、肿瘤大小、浸润深度、组织分化程度患者的miR-196b水平差异无统计学意义;80例宫颈癌病理标本中miR-196b高表达率为76.25%,低表达率为23.75%,HPV18阳性组的miR-196b高表达率明显高于HPV阴性组, ⅡB~Ⅲ分期的miR-196b高表达率明显高于Ⅰ~ⅡA分期,且miR-196b高表达患者的平均生存时间明显短于miR-196b低表达患者,提示miR-196b高表达不仅与宫颈癌的发生发展密切相关,还与HPV18的阳性率具有一定的关系[10-13]。本研究中miR-196b在宫颈癌组织中表达上调,初步揭示宫颈癌的发生与miRNA的表达异常具有一定的相关性,并且miR-196b与患者的淋巴转移、远处转移、临床分期、HPV18感染明显相关[14-15],miR-196b的表达水平也与患者的生存时间密切相关,表明miR-196b可能是一种重要的宫颈癌预后评价指标,但仍需进一步严格的前瞻性研究证实。
综上所述,miR-196b高表达的患者往往预示其感染HPV18的风险增大,且患者预后结局较差、生存时间缩短,临床可通过HPV18感染与miR-196b之间的关系研究,初步评估患者的病情与预后结局,进而为临床针对性治疗提供参考依据。