茶多酚对宰后牦牛肉线粒体细胞凋亡和肌肉嫩度的影响

王琳琳 陈炼红 韩 玲 李 键 余群力 蔡自建

(1.西南民族大学生命科学与技术学院， 成都 610041； 2.甘肃农业大学食品科学与工程学院， 兰州 730070)

0 引言

嫩度是评价肌肉品质的重要指标之一。肉品科学领域早期研究指出，肌细胞内钙激活酶和组织蛋白酶两大内源酶系能对肌纤维骨架蛋白进行降解，进而起到改善肌肉嫩度的作用[1]。随着肌肉嫩化理论的不断完善，内源性细胞凋亡酶(Caspase)被证实也能降解肌原纤维蛋白，并成为参与宰后肌肉嫩化过程的第三大内源酶系[2]。细胞凋亡是细胞在接受某种信号或某些刺激后发生的一种自主有序的死亡过程，也称为程序性死亡，它分为内源性线粒体凋亡途径和外源性死亡受体途径，其中线粒体凋亡途径被认为是引起肌肉嫩度改善的主要途径[3]。而细胞色素c(Cyt-c)从线粒体释放到胞浆的过程对线粒体细胞凋亡途径的激活具有重要意义，且此过程与MPTP密切相关。MPTP是位于线粒体内、外膜之间，由多种线粒体蛋白构成的非特异性复合孔道，主要受到线粒体Ca2+超载和ROS介导的氧化应激调控，是近年来研究凋亡途径激活机制的主要方向[4]。

茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称，也是一种复合型的天然抗氧化剂，具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗肿瘤、抗辐射等功能[5]。在细胞凋亡研究领域，对茶多酚在凋亡发生过程中的作用存在诸多争议，有研究者指出，茶多酚可通过对抗细胞内氧化应激起到抑制细胞凋亡的作用，也有学者持相反观点。文献[6]研究发现，茶多酚可抑制由高糖诱导的人晶状体上皮细胞凋亡，同时茶多酚也能对甲基汞所致大鼠大脑皮质神经元的氧化损伤起保护作用，并降低细胞凋亡率[7]。虽然茶多酚在多种细胞模型中都被证实能够抑制细胞凋亡，但也有学者认为，茶多酚可能通过不同的信号通路和途径在不同的细胞模型中发挥诱导凋亡作用。文献[8]研究发现，在羊肉宰后成熟过程中茶多酚可通过促进pro-Caspase-3(Caspase-3酶原)降解激活Caspase-3，进而诱导细胞凋亡的发生。茶多酚也可能通过导致ROS过量积累、激发Caspase级联反应发生，进而诱导细胞凋亡[9]。茶多酚可剂量依赖地诱导卵巢癌SKOV3细胞发生凋亡，且这种诱导作用可能是通过增加细胞内的ROS水平而实现的[10]。同时，茶多酚活性成分没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)也可通过多种方式诱导细胞凋亡[11]。茶多酚对细胞凋亡途径的作用受到诸多因素影响，如细胞类型、浓度、信号通路以及活性成分等。目前，在肉品科学领域茶多酚主要作为抗氧化剂和保鲜剂起到改善肌肉品质、延长货架期的作用[12]。而在肌肉宰后细胞凋亡发生过程中，茶多酚起诱导凋亡作用还是抑制凋亡作用，并对肌肉嫩度造成何种影响，尚未见相关研究报道。

本文以茶多酚处理的牦牛背最长肌为试验对象，测定肌肉宰后成熟过程中对照组和茶多酚组线粒体氧化应激水平、线粒体氧化损伤程度、线粒体功能特性、线粒体细胞凋亡进程，以及嫩度的变化，探究茶多酚对宰后牦牛肉线粒体氧化应激水平的影响和茶多酚在宰后肌肉成熟过程中对细胞凋亡发生的影响作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料：随机选取平均年龄3.5岁、生长发育良好、体质量相近，在相同饲养环境条件下生长的牦牛10头(青海百德投资发展有限公司提供)，宰前禁食16～18 h，禁水2 h。

试验试剂：甘露醇、蔗糖、乙二胺四乙酸(EDTA)、4-丙磺酸基吗啉、牛血清白蛋白(BSA)、硫酸铜、2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、1-苯胺-8萘磺酸(ANS)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)、连二亚硫酸钠、氯化钠(KCl)、磷酸钾(K3PO4)、氯化镁(MgCl2)、叠氮化钠(NaN3)，以上试剂均为分析纯；SOD(线粒体超氧化物歧化酶)活性检测试剂盒、MDA(丙二醛)含量检测试剂盒、羰基含量检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；Caspase-3活性检测试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司。

1.2 仪器与设备

XH-B型旋涡混合器，江苏康健医疗用品有限公司；HH-4型恒温水浴锅，北京科伟永兴有限公司；TGL-16M型高速台式冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；XHF-D型高速分散内切式匀浆仪，浙江宁波新芝生物科技股份有限公司；RF 5301-PC型荧光分光光度计，日本岛津公司；UV2550型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；Spectramax M2型酶标仪，美国美谷分子仪器有限公司；BX61型正置万能显微镜，日本Olympus公司。

1.3 试验方法

1.3.1样品采集和处理

宰后从胴体上取背最长肌(Longissimusdorsi，LD)，并迅速将其切成大小相同质量在60 g左右的肉样，取3块放入液氮中作为0 h样品，并将其余肉样随机分成两组，第1组均匀注射质量分数为0.3%的茶多酚溶液(料液比10 g/mL)，未经任何处理的肉样作为空白对照样品，将上述样品置于0～4℃条件下，自然成熟0、6、12、24、72、120、168 h，并在相应时间点取样后放入-80℃超低温冰箱中待测。

1.3.2线粒体提取

参照文献[13]的方法，将牦牛背最长肌肉样剪碎后置于10倍体积的线粒体分离介质(220 mmol/L甘露醇、70 mmol/L蔗糖和2.0 mmol/L EDTA，5.0 mmol/L 4-丙磺酸基吗啉和0.5% BSA，pH值7.4)中，用高速匀浆机匀浆。匀浆液于4℃、1 000g离心10 min，相同条件下两次离心后，取上清液再8 000g离心20 min，所得沉淀为线粒体，上清液为胞浆。用双缩脲法测定蛋白质量浓度。

1.3.3线粒体ROS水平测定

参照文献[14]的方法并稍作修改。纯化的线粒体悬浮液(蛋白质量浓度0.1 mg/mL)与含有5 μmol/L DCFH-DA荧光试剂的50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值7.4)混合均匀后，将上述混合溶液迅速转入37℃水浴锅中避光孵育15 min，随后于4℃、12 000g条件下离心8 min，立即用荧光分光光度计测定线粒体荧光强度(激发波长、发射波长分别为488、525 nm)，并将测定荧光强度后的样品置于荧光显微镜下，观察线粒体荧光水平。

1.3.4SOD活性、MDA含量以及羰基含量测定

参照试剂盒说明书的方法测定线粒体SOD活性、线粒体MDA含量及线粒体羰基含量。

1.3.5线粒体膜流动性测定

参照文献[15]的方法，取0.3 mol/L甘露醇5.65 mL、5 mmol/L ANS溶液60 μL加入到0.3 mL纯化的线粒体悬浮液中，并混合均匀。1 min后用荧光分光光度计测定混合液的荧光强度(激发波长、发射波长分别为400、480 nm)，狭缝宽度5 nm。

1.3.6MPTP开放程度测定

参照文献[4]的方法，用3 mL MPTP测试介质(230 mmol/L甘露醇、70 mmol/L蔗糖，3.0 mmol/L Hepes，pH值7.4)将纯化的线粒体蛋白质量浓度调至0.3 mg/mL，取1 mL定量好的线粒体悬液与3 mL MPTP测试介质混匀后，用紫外分光光度计在540 nm处测定吸光度。

1.3.7线粒体和胞浆中Cyt-c浓度测定

参照文献[16]的方法，用超声波仪在冰浴下破碎纯化的线粒体，然后取破碎后的线粒体悬浮液和胞浆各1.5 mL，向其中分别加入0.025 g连二亚硫酸钠并摇匀，最后在520 nm处测定吸光度，并由标准曲线计算线粒体和胞浆中Cyt-c浓度。

1.3.8Caspase-3活性测定

Caspase-3活性参照试剂盒说明书的方法进行测定。

1.3.9MFI测定

参照文献[17]的方法，取2 g肌肉样品，加入10倍体积MFI(肌原纤维小片化指数)缓冲液(100 mmol/L KCl、20 mmol/L K3PO4、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L NaN3，pH值7.1)，用匀浆机进行匀浆。匀浆液于4℃、1 000g离心15 min。沉淀用20 mL MFI缓冲液溶解，并于相同条件下离心15 min，弃上清液。向沉淀中加入10 mL MFI缓冲液，混匀后用200目尼龙筛网过滤以除去结缔组织碎片。用双缩脲法测定肌原纤维蛋白悬液的蛋白浓度，并用MFI缓冲液将肌原纤维蛋白质量浓度稀释至0.5 mg/mL，然后在540 nm处测定吸光度，吸光度乘以200即为MFI。

1.4 数据处理

试验结果均采用平均值±标准差表示，数据平行测定3次。用SPSS 19.0软件进行方差分析(ANOVA)，用新复极差法(Duncan)进行多重比较，用Origin 8.5软件进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 线粒体氧化应激水平

ROS是由线粒体产生的重要信号分子，生理状态下一定水平的ROS对于细胞增殖和信号传导具有重要作用，但ROS的过多积累会造成脂质过氧化和蛋白质氧化，细胞内酶的失活以及DNA的氧化损伤，进而引发细胞内部一系列氧化应激损伤，且其被证明是诱导细胞凋亡发生的主要原因之一[18]。目前，主要采用DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平，DCFH-DA可以自由穿过细胞膜并被细胞内的酯酶水解生成DCFH(2，7-双氯荧光素蛋白)，而ROS能将无荧光的DCFH氧化成有荧光的DCF(二氯荧光素)，且绿色荧光越多，说明ROS水平越高[19]。由图1可知，对照组和茶多酚组线粒体ROS荧光强度均随着成熟时间延长呈先下降后上升再下降的变化趋势；成熟过程中，茶多酚组发绿色荧光的线粒体数量明显少于对照组，说明茶多酚组线粒体ROS水平低于对照组，表明茶多酚处理能在一定程度上降低线粒体ROS水平。

氧化应激是当细胞内ROS的过多积累超过内源性抗氧化防御系统对其的消除能力时过剩的ROS就会参与氧化生物大分子，从而造成细胞毒性或者线粒体损伤的生物学过程[20]。由图2a(图中小写字母表示对照组指标在成熟过程中变化差异显著(P<0.05)，大写字母表示茶多酚组指标在成熟过程中变化差异显著(P<0.05)；对照组和茶多酚组指标在同一成熟时间点变化差异显著用“*”(P<0.05)表示，差异极显著用“** ”(P<0.01)表示，下同)可看出，宰后成熟过程中，对照组和茶多酚组线粒体ROS水平呈先下降后上升再下降的变化趋势(P<0.05)，与图1基本吻合，原因可能是宰后缺氧缺血环境致使线粒体ROS不断增多，但因线粒体基质和线粒体膜中存在的SOD、过氧化氢酶等内源抗氧化酶和非酶抗氧化因子的作用有效清除了部分ROS，但随着线粒体自身抗氧化能力的减弱，在成熟后期两组肉样线粒体ROS水平又呈现上升趋势，文献[21]研究发现，在鹅肉成熟早期肌肉中ROS的相对含量也是呈先下降后上升的变化，与本研究结果一致。0～72 h，茶多酚组线粒体ROS水平均极显著低于对照组(P<0.01)，说明茶多酚通过抑制自由基的链式反应显著降低了线粒体ROS水平进而减弱线粒体的氧化应激强度，并可能进一步对细胞凋亡进程造成影响。SOD是细胞内重要的抗氧化酶之一，可以专一性地清除细胞内的ROS，是线粒体氧化损伤的重要评价指标。如图2b所示，两组肉样线粒体SOD活性整体呈先上升后下降的变化趋势。24 h后，茶多酚组SOD活性显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于对照组，说明茶多酚能够通过提高线粒体抗氧化酶SOD活性而对ROS进行清除，起到有效降低线粒体氧化应激水平的作用。

图1 茶多酚处理对宰后牦牛肉成熟过程中线粒体ROS荧光强度的影响Fig.1 Effects of tea polyphenol on fluorescence intensity of ROS of yak LD muscle during postmortem aging

图2 茶多酚处理对宰后牦牛肉线粒体ROS水平和SOD活性的影响Fig.2 Effects of tea polyphenol on level of ROS and SOD activity of yak LD muscle during postmortem aging

2.2 线粒体氧化应激损伤程度

过量产生的ROS主要通过攻击生物膜上的不饱和脂肪酸进而引起膜的脂质过氧化。MDA可直接反映细胞的脂质过氧化程度，也可间接反映细胞损伤程度，进而可表征细胞的氧化应激损伤的程度[22]。如图3a所示，宰后6～120 h，茶多酚组MDA含量均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)低于对照组，说明茶多酚通过提高肌细胞线粒体SOD活性清除ROS的同时，有效降低了线粒体脂质过氧化程度，有研究证实茶多酚处理确实通过抑制细胞脂质过氧化而降低了由ROS造成的氧化应激损伤[23]；茶多酚也可通过降低MDA含量，增强SOD活性而影响凋亡，起到抵抗乳腺上皮细胞氧化应激损伤的作用[24]；但也有研究指出，茶多酚并未通过降低细胞内ROS水平降低细胞的氧化应激水平，与本研究结果不一致，反而起相反作用[25]。

细胞内过量产生的ROS不只攻击线粒体膜上的不饱和脂肪酸，同时也会引起蛋白质的羰基化和蛋白质之间的交联和聚集，造成蛋白质氧化进而影响正常蛋白质的活性与功能[21]。如图3b所示，宰后6～72 h，茶多酚组线粒体羰基含量均极显著低于对照组(P<0.01)，原因是茶多酚显著抑制了线粒体蛋白质的氧化，降低了线粒体的氧化应激损伤程度。氧化应激引起的线粒体膜脂质和蛋白质的过氧化，会不同程度地降低线粒体膜的流动性，其也可用来评判线粒体膜的氧化损伤情况[26]。由图3c可知，宰后6～24 h和120 h，茶多酚组线粒体膜流动性均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于对照组，也进一步证实茶多酚通过降低线粒体氧化应激水平，降低了线粒体氧化应激损伤，提高线粒体膜流动性，对线粒体起到保护作用。

图3 茶多酚处理对宰后牦牛肉线粒体氧化损伤程度的影响Fig.3 Effects of tea polyphenol on degree of oxidative damage to mitochondria of yak LD muscle during postmortem aging

2.3 线粒体功能

线粒体被认为是细胞凋亡发生的中枢调控者，对凋亡过程起着极其重要的调控作用，而作为线粒体进行内外信息传递的枢纽，MPTP的开放状态是线粒体调控细胞凋亡发生的重要环节，MPTP的开放程度直接关系到线粒体Cyt-c的释放情况以及凋亡的发生进程[27]。有研究指出，肌细胞在严重缺氧的应激状态下时，线粒体ROS大量产生，促使线粒体内外膜间的MPTP构象改变，形成孔道后使线粒体内外膜间的各种促凋亡因子大量释放，最终引发细胞凋亡级联反应[28]。由图4可知，6～12 h，两组MPTP开放程度无显著差异，而在成熟24 h后，茶多酚组MPTP开放程度显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)低于对照组，说明茶多酚通过降低线粒体氧化应激损伤对线粒体结构和功能起到一定的保护作用，也可在一定程度上抑制MPTP介导线粒体Cyt-c的释放，可能对线粒体细胞凋亡进程起到阻碍作用。文献[29]研究指出，H2O2处理后的牦牛肉在宰后成熟过程中MPTP的开放程度均强于对照组和抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理组，且NAC处理组MPTP的开放程度最弱，与本研究类似，均表明抗氧化剂起到保护线粒体功能的作用，降低了MPTP的开放程度，进一步对细胞凋亡级联反应起抑制作用。

图4 茶多酚处理对宰后牦牛肉成熟过程中MPTP开放程度的影响Fig.4 Effect of tea polyphenol on MPTP opening of yak LD muscle during postmortem aging

2.4 成熟过程中细胞凋亡进程

2.4.1线粒体Cyt-c释放程度

Cyt-c作为线粒体呼吸传递链中的基本成分，在氧化还原和能量代谢过程中发挥重要作用，同时Cyt-c在线粒体细胞凋亡途径的激活中也起到重要的调控作用。当MPTP开放并伴随线粒体膜电位下降时，Cyt-c从线粒体释放到胞浆中后，与胞浆中Apaf-1(凋亡蛋白活性因子-1)和Caspase-9前体结合形成凋亡小体，激活下游Caspase-3，并引发Caspase级联反应信号逐级放大最终诱导凋亡发生，Cyt-c的释放程度对线粒体凋亡的发生具有非常重要的介导作用[30]。由表1分析可知，宰后成熟过程中(6～168 h)，茶多酚组线粒体Cyt-c浓度均高于对照组，并在12 h和72 h存在显著差异，说明茶多酚通过防护线粒体氧化损伤以及对其功能的保护作用，减弱了MPTP对Cyt-c的释放。宰后6～12 h，茶多酚组胞浆Cyt-c浓度显著低于对照组，说明茶多酚在成熟早期显著抑制了线粒体Cyt-c的释放；同时，成熟72 h后，茶多酚组胞浆Cyt-c浓度均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于对照组，表明随着茶多酚抗氧化能力的减弱，线粒体在成熟后期受到ROS介导的氧化应激损伤，使其大量释放Cyt-c而导致胞浆Cyt-c增多。

表1 茶多酚处理对宰后牦牛肉成熟过程中Cyt-c释放程度的影响Tab.1 Effect of tea polyphenol on release of Cyt-c of yak LD muscle during postmortem aging

2.4.2Caspase-3活性

细胞凋亡的发生受到诸多因素影响，其中ROS介导的氧化应激被认为是诱导凋亡发生的主要因素之一，也是近年来的研究热点。上述结果表征了茶多酚对线粒体氧化应激的影响，进而推测茶多酚可能会因对ROS的清除作用而影响其对细胞凋亡的介导作用。如图5所示，宰后6～12 h，茶多酚组Caspase-3活性显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)低于对照组，说明与对照组相比，茶多酚确实在成熟早期通过抑制线粒体Cyt-c的释放而抑制了Caspase-3的激活，进而抑制了凋亡信号的逐级放大。而24～72 h，茶多酚组Caspase-3活性显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于对照组，说明随着茶多酚抗氧化作用的减弱，对线粒体的保护作用相应下降而导致胞浆中不断增加的Cyt-c起到介导线粒体凋亡发生的作用；然而也有研究指出，羊肉经茶多酚处理后反而促进了线粒体Cyt-c的释放和Caspase-3的激活，与本研究结果相反，原因可能是所选骨骼肌类型和所探讨的分子机制不同[8]。而在成熟后期(120～168 h)，茶多酚组Caspase-3活性低于对照组，原因可能是茶多酚通过影响Bcl-2家族蛋白表达而对凋亡过程进行调控[31]。

图5 茶多酚处理对宰后牦牛肉成熟过程中Caspase-3活性变化的影响Fig.5 Effect of tea polyphenol on changes in Caspase-3 activity of yak LD muscle during postmortem aging

Bcl-2家族蛋白是线粒体凋亡途径的主要调控者，Bcl-2(抗凋亡蛋白)和Bax(促凋亡蛋白)二者比例的变化对凋亡发生具有重要调控作用，当Bax/Bcl-2比例下降时会进一步抑制凋亡发生[32]。ROS介导的氧化应激也会通过提高Bax/Bcl-2的比例而诱导凋亡发生，抗氧化剂则可通过降低Bax/Bcl-2的比例抑制线粒体Cyt-c的释放，进而抑制凋亡级联反应扩大[33-34]。同时，茶多酚可抑制在H2O2介导下牙周膜细胞的活性降低、凋亡程度升高，MDA含量增加伴随SOD活性降低，Caspases和Bax的表达升高以及Bcl-2的表达降低，说明茶多酚通过减轻细胞氧化应激损伤，抑制线粒体细胞凋亡进程而对牙周膜细胞起保护作用[35]，与本研究结果类似。然而，也有研究指出茶多酚通过提高细胞内ROS水平，加剧线粒体损伤诱导卵巢癌细胞凋亡[10]，与本研究结果不一致，原因可能是所用细胞类型以及参与机制不同，相关具体机制有待进一步研究。

2.5 成熟过程中肌肉嫩化

肌肉宰后成熟过程中，肌原纤维蛋白如伴肌动蛋白、伴肌球蛋白、肌间线蛋白以及肌钙蛋白-T等骨架蛋白的降解促使肌原纤维M线消失、I带和Z线断裂，进一步导致肌原纤维有序排列遭到破坏，细丝结构弱化进而增加MFI，最终达到嫩化目的[34]。同时，MFI常被用来作为肌肉嫩化程度的评价指标。如图6所示，随着成熟时间的延长，两组肉样MFI均呈显著上升变化规律(P<0.05)，说明宰后成熟过程中肌肉嫩化过程不断进行，肌肉嫩化程度不断增强，肌肉嫩度不断得到提高，文献[17]研究也证实在牦牛肉宰后成熟过程中MFI呈显著上升趋势，与本研究结果一致。同时，成熟早期(6～24 h)，茶多酚组MFI均极显著低于对照组(P<0.01)，说明茶多酚通过抑制线粒体细胞凋亡进程进一步抑制了其对肌肉嫩度的改善作用。宰后72 h，随着茶多酚抑制凋亡级联反应作用的减弱，Caspases继续起到降解下游肌原纤维蛋白的作用，从而使肌肉嫩化程度得到增强，但在成熟后期(120～168 h)，可能因茶多酚通过其他方式抑制了凋亡进而对肌肉嫩化起到一定阻碍作用。以上研究说明，茶多酚不仅通过抗氧化作用对肌肉色泽、货架期等起保护作用，同时也可能通过其他方式或途径影响肌肉嫩度，具体机制有待进一步研究。

图6 茶多酚处理对宰后牦牛肉成熟过程中MFI变化的影响Fig.6 Effect of tea polyphenol on changes in MFI of yak LD muscle during postmortem aging

3 结论

(1)茶多酚通过降低线粒体ROS水平和提高线粒体SOD活性，减弱了牦牛肉宰后成熟过程中线粒体氧化应激水平，并进一步抑制了氧化应激对线粒体脂质过氧化和蛋白质的氧化损伤，对线粒体结构和功能均起到一定保护作用。同时，茶多酚通过对线粒体结构和功能的保护，进一步抑制了线粒体Cyt-c的释放以及Caspase-3的活化，从而抑制了线粒体细胞凋亡级联反应进程，并最终阻碍了肌肉嫩化过程。

(2)宰后牦牛肉成熟过程中，茶多酚可通过抑制ROS介导的氧化应激对线粒体结构和功能的损伤，起到抑制线粒体细胞凋亡级联反应改善肌肉嫩度的作用，表明茶多酚在发挥抗氧化剂和保鲜剂作用、提高肌肉品质的同时，通过抑制线粒体细胞凋亡途径对肌肉嫩化产生不利影响。