垃圾渗滤液处理菌株的筛选及处理工艺条件的优化

贺晓凌，赵丹瑜，张佩莲，向雪艳，李卓轩，魏东盛

（1.天津工业大学 化学与化工学院，天津 300387；2.天津工业大学环境科学与工程学院，天津 300387；3.南开大学生命科学学院，天津 300071）

近年来，我国城镇居民的生活垃圾产生量以惊人的速度增长，预计到2030 年将达到4.10 亿吨[1]。这些生活垃圾以各种形式危害人类健康、污染生态环境。因此，生活垃圾的处理已经成为我国当前亟待解决的重要问题之一。

目前，世界各国处理城市生活垃圾的方法主要包括3 类：卫生填埋法、焚烧法以及堆肥法[2]。卫生填埋是一种对垃圾终极处理的方法，由于其投资成本较小、技术简单、垃圾处理量大等优点被广泛应用[3]。但是，卫生填埋处理法不可避免地会产生垃圾渗滤液[4]。垃圾渗滤液是一种经过填埋场内垃圾的渗透而变得污浊的液体[5-6]，具有有机物浓度高、毒性大、微生物营养元素比例失调等特点，属于极难处理的一类污水[7-11]。而生物法具有处理效果好、投资较小、运行费用低等优点，适用于降解可生化性较好的渗滤液[12-13]，是目前应用最多、降解效果最佳的处理方法。邱忠平等[14]研究发现混合菌株对垃圾渗滤液的降解性能最好，在温度30 ℃、pH 值 7、时间 120 h 的最佳降解条件下，COD 去除率达到45.3%。吉芳英等[15]研究表明投加了功能菌的生物活性炭对分子量M 为100 ～30 kDa 的垃圾渗滤液有机污染物去除率为76.1%，对M ＞100 kDa 的有机污染物去除率为80.9%。然而，在实际垃圾渗滤液处理过程中，由于自然环境的恶劣，这些菌株的性能往往会受到很大影响。

本文从各种菌源筛选培育出适于处理垃圾渗滤液的优势菌株，进行分子生物学鉴定；为进一步提高菌株降解能力，以垃圾渗滤液的COD 降解率为指标，采用Plackett-Burman（PB)实验法筛选出影响菌株处理垃圾渗滤液的3 个主要因素，在此基础上通过最陡爬坡实验接近最大响应值区域后，采用响应面分析法对主要因素进行优化，确定优势菌株处理垃圾渗滤液的最优工艺条件。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

材料：垃圾渗滤液废水、实验菌株，均来自天津市北辰区双口生活垃圾卫生填埋场；葡萄糖、蛋白胨、琼脂粉等药品，天津市光复精细化工研究所产品；实验用水均为蒸馏水，市售。

仪器：DP321 型DNA 提取系统，北京市天根生化科技有限公司产品；TG16G 型台式高速离心机，长沙市凯达科学仪器有限公司产品；SHZ-82A 型恒温气浴振荡器，金坛市荣华仪器制造有限公司产品；GDYS-101SQ2 型COD 测定仪，天津市盛鑫泰仪器仪表有限公司产品。

1.2 培养基制备

（1）垃圾渗滤液培养基：琼脂粉1.0～1.5 g，渗滤液废水稀释 2 倍，蒸馏水 100 mL，pH 6.5～7.5。

（2）PDA 培养基：马铃薯煮出液 20.0 g，葡萄糖2.0 g，磷酸二氢钾 0.3 g，琼脂粉 1.0～1.5 g，蒸馏水 100 mL，pH 自然。

（3）马丁氏培养基：葡萄糖1.0 g，蛋白胨0.5 g，磷酸二氢钾 0.1 g，硫酸镁 0.024 g，琼脂粉 1.0～1.5 g，蒸馏水 100 mL，pH 自然。

1.3 菌株筛选

实验菌株来源于天津市北辰区双口生活垃圾卫生填埋场7 处不同地点的土样。称取适量1—7 号土样，各加入适量灭菌的蒸馏水，配成菌液，不断搅拌使其溶解均匀；待土样沉淀后取0.1 mL 上清液涂布在20 mL 垃圾渗滤液培养基上，每3 d 更换一次培养基。经过半个月的驯化过程，用灭菌的接种环挑取驯化后的菌株接种于垃圾渗滤液平板培养基上，将培养基于室温下培养3 d，观察培养基上是否长出菌丝及菌丝生长情况，筛选出优势菌株。

1.4 菌株鉴定

1.4.1 形态学鉴定

用灭菌接种环挑取上述筛选后的优势菌丝重复划线接种在灭菌的PDA 培养基平板上，在28 ℃下培养2 d，平板上长出纯化后的单菌落，选取菌落形态明显的平板进行形态学观察。

1.4.2 分子生物学鉴定

将筛选的优势菌株在灭菌的PDA 培养基上于28 ℃下培养2 d，转接到灭菌的PDA 液体培养基中，于28 ℃、150 r/min 条件下，摇床震荡培养2 d。将菌液在10 000 r/min 下离心10 min，缓慢倾倒上清液，收集菌丝体。采用快捷型植物基因组DNA 提取系统（Cat：DP321）对上述离心所得菌丝进行基因组提取。以提取的菌株DNA 为模板，以ITS1、ITS4 为引物进行聚合酶链反应（PCR）扩增16S rDNA。PCR 扩增体系为：PrimeSTAR HS（Premix，2X）25 uL，ITS1 0.5 uL，ITS4 0.5 uL，模板 DNA 1 uL，去离子水 23 uL。PCR 扩增条件为：98 ℃ 10 s，60 ℃ 5 s，72 ℃ 1 min，30 个循环。将扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，纯化并回收后送至华大基因科技股份有限公司进行16S rDNA 测序。将优势菌株的16S rDNA 测序结果与Gen Bank 中的已知序列进行BLAST 比对，寻找相似度最高的序列信息，进行同源性分析[16]。通过MEGA 5.0 软件构建系统发育树，确定菌株的系统分类学地位。

1.5 菌液的制备

用灭菌的枪头挑取PDA 平板培养基上的优势菌株，接种至马丁氏液体培养基中，于28 ℃、150 r/min条件下，摇床震荡培养24 h，获得对数期（OD600=0.7）的菌液浓度。

1.6 垃圾渗滤液的COD降解实验

向2 个三角瓶中准确加入100 mL 渗滤液，经测定pH 值为7，将2 个三角瓶于121 ℃条件下灭菌30 min后取出，待渗滤液冷却后分别加入体积分数为5%的菌液，于28 ℃、150 r/min 条件下，摇床培养 5 d。取降解前后的垃圾渗滤液水样，在离心机10 000 r/min 条件下离心10 min，取其上清液，使用快速COD 测定仪测定COD 值，并根据式（1）计算垃圾渗滤液的COD 降解率。

式中：COD0为降解前垃圾渗滤液中的COD 值（mg/L）；COD1为降解后垃圾渗滤液中的COD 值（mg/L）。

1.7 垃圾渗滤液降解条件的优化

1.7.1 Plackett-Burman 实验

选择可能影响菌株降解垃圾渗滤液的7 个因素进行考察，包括蛋白胨质量浓度（A）（mg/mL）、葡萄糖质量浓度（B）（mg/mL）、pH 值（C）、接种量（D）（%）、处理天数（E）、磷酸二氢钾质量浓度（F）（mg/mL）、硫酸镁质量浓度（G）（mg/mL）。采用 Factors=7、Runs=12 的Plackett-Burman 设计，每个因素取（+）、（-）2 个水平，各因素与水平如表1 所示。根据Plackett-Burman 实验设计，在28 ℃、150 r/min 条件下做垃圾渗滤液的降解实验，通过Design-Expert.V8.0.5 软件对实验结果进行主效应分析，确定影响降解效果的3 个显著因子。

表1 Plackett-Burman 实验设计因素与水平值Tab.1 Factors and level-value of Plackett-Burman experiment designed

1.7.2 最陡爬坡实验

响应面只有在临近最佳值时才能建立有效的响应面方程，因此，必须尽可能接近最大COD 降解率区域后才能建立有效的响应面拟合方程。最陡爬坡实验以实验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，从而快速接近最大响应值区域[17]。本文根据Plackett-Burman 实验结果筛选出主要影响因素，做最陡爬坡实验。

1.7.3 响应面实验

根据最陡爬坡试验结果，以主要影响因素的水平为自变量，以垃圾渗滤液COD 降解率为响应值，借助设计软件Design Expert.V 8.0.5 进行Box-Benhnken 设计，对得到的回归模型进行方差分析和显著性检验，求得最优值，得出响应面分析结果，进而确定最佳降解条件，绘制响应面分析图。在所得最优降解条件下进行3 次重复实验，以验证结果的可靠性。

2 结果与讨论

2.1 菌株的筛选结果

来源于天津市北辰区双口生活垃圾卫生填埋场7处不同地点土样的菌源经平板室温培养3 d 后，结果显示 1、3 号渗滤液培养基上菌株长势不明显；2、4、5、6 号渗滤液培养基上有少量菌株生长；7 号渗滤液培养基上有大量菌株生长，长势较好，即获得优势菌株Z7，如图1 所示。

图1 优势菌株Z7Fig.1 Dominant strain Z7

猜测仅有7 号渗滤液培养基上菌株长势良好的原因，可能是在本实验条件下，来源于7 号土样的菌株可以更好地抵御垃圾渗滤液的干扰。

2.2 菌株Z7的鉴定结果

2.2.1 形态学鉴定结果

对筛选出的优势菌株Z7 进行菌落形态学观察。菌株Z7 经纯化后获得单菌落，在PDA 培养基上于28 ℃培养2 d 后，菌落形态特征如图2 所示。观察发现，菌株Z7 为绒毛状且呈放射状，菌株外围一圈为黄色，由外到内向白色过渡，中部为白色，有凸起，不透明，厚实，表面湿润。

图2 优势菌株Z7 的形态特征Fig.2 Morphological characteristics of dominant strain Z7

2.2.2 分子生物学鉴定结果

将筛选出的优势菌株Z7 的16SrDNA 序列与Gen-Bank 中其他同源序列进行比较，BLAST 用于搜索基因同源性，构建系统发育树[18]，如图3 所示。所得菌株Z7与镰刀菌相似性达到99%，因此，命名为Fusariumchlamydosporum TJPU02。该菌株可在极冷或极热的恶劣环境中生存，生存效率高[19]。

图3 菌株Z7 的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain Z7

2.3 菌株TJPU02降解垃圾渗滤液工艺条件的优化

2.3.1 Plackett-Burman 实验设计结果分析

根据表1 的Plackett-Burman 实验设计，得到实验结果如表2 所示，各因素水平及效应分析如表3 所示。

表2 Plackett-Burman 实验结果Tab.2 Results of Plackett-Burman experiment

表3 Plackett-Burman 实验方差分析表Tab.3 Variance analysis of Plackett-Burman experiment

由表3 中P 值大小可以看出，对菌株TJPU02 降解垃圾渗滤液COD 具有显著影响的因素为A 蛋白胨质量浓度（P=0.040 1 ＜ 0.05）、B 葡萄糖质量浓度（P=0.023 8 ＜ 0.05）、D 接种量（P=0.030 9 ＜ 0.05）和 E 处理天数（P=0.046 9 ＜ 0.05），影响显著性大小依次是 B ＞D ＞A ＞E，即葡萄糖质量浓度＞接种量＞蛋白胨质量浓度＞处理天数，确定前3 个因素为主效应因素，进行下一步的最陡爬坡实验。由效应值可知，接种量对降解垃圾渗滤液效果的影响为正效应，在后续最陡爬坡试验中应增加接种量。一般情况下，当底物一定时，增加一定程度的接种量，使更大密度的菌株与底物反应，可以加快降解速度。蛋白胨和葡萄糖的质量浓度对降解垃圾渗滤液效果的影响为负效应，在后续最陡爬坡试验中应降低蛋白胨和葡萄糖的添加量。蛋白胨和葡萄糖都属于营养物质，营养过剩会使菌株的代谢过快，损伤大，不利于发挥其降解垃圾渗滤液的能力。

2.3.2 最陡爬坡实验结果

针对Plackett-Burman 实验筛选出的关键因素进行最陡爬坡实验。正效应从低值向上增加，负效应从高值向下减小。以蛋白胨质量浓度每次减少1，接种量每次增加1，葡萄糖质量浓度每次减少1 为基本步长，最陡爬坡实验设计及其结果如表4 所示。

表4 最陡爬坡实验设计及其结果Tab.4 Experimental design of steepest ascent and corresponding results

由表4 可知，从实验1 至实验4，COD 降解率明显上升，以实验 4 为条件值时，COD 降解率达到82.40%，之后开始下降，所以选择实验4 中的条件值作为下一步响应面实验设计的中心值。

2.3.3 Box-Benhnken 实验设计及结果

根据Plackett-Burman 实验和最陡爬坡实验数据分析结果，得到3 个显著因子：蛋白胨质量浓度、接种量和葡萄糖质量浓度以及各自的中心值点。在此基础上设计了三因素三水平共17 个实验点的Box-Behnken 响应面实验因素水平表如表5 所示，实验设计及结果如表6 所示。

表5 Box-Behnken 实验因素与水平Tab.5 Factors and levels of Box-Behnken experiment

表6 Box-Benhnken 实验设计和结果Tab.6 Design and results of Box-Benhnken experiment

根据表6 的实验结果，通过Design Expert.V 8.0.5软件处理确定回归方程。该实验的回归方程为：

上述回归模型的方差分析如表7 所示。

由表7 可知，回归模型 P（Prob ＞ F）=0.010 4，表明模型是显著的。失拟项P 值为0.068 5，表明该模型回归极显著，失拟不显著。多元相关性系数R2=0.979 2，表明仅有不到2.08%的变异不能由此模型解释，回归模型可以与COD 降解率的实际变化拟合得很好。变化系数（CV）越低，实验的可信度和精确度越高，CV=2.61%，表示实验操作可信，实验数据可靠。因此，可以用该模型对X1（蛋白胨质量浓度）、X2（接种量）、X3（葡萄糖质量浓度）培养条件下的COD 降解率进行分析和预测。此外，由各因素P 值大小可知，各因素对COD降解率影响的显著性顺序为X3＞X2＞X1，即葡萄糖质量浓度＞接种量＞蛋白胨质量浓度。为提高菌株TJPU02 降解COD 的能力，菌株需更好地繁殖和生长。微生物的生长离不开营养物质如水、碳源、氮源、无机盐、生长因子和能源的支持，而葡萄糖提供碳源，蛋白胨提供氮源[20]。

2.3.4 响应面交互作用分析与优化

针对相关变量间的相互作用及确定最大优势等问题，利用Design-Expert V8.0.5 软件绘制响应面曲线，并完成可视化分析。图4—图6 为3 组测试参数的趋势图和等高线图，以COD 降解率作为响应值。

图4 为蛋白胨质量浓度和接种量对COD 降解率影响的响应面图。由图4（a）三维图凸起程度可以看出，蛋白胨质量浓度和接种量对COD 降解率的影响较为显著。等高线图可以直观地反映两变量交互作用的显著程度，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形与之相反[21]。图4（b）中等高线呈椭圆形，表明两因素间交互作用显著。图4（b）表明在实验设定范围内，当蛋白胨质量浓度不变时，随着接种量增加，COD 降解率呈现正峰变化，在接种量为6%左右时，COD 降解率达到高值；当接种量不变时，随蛋白胨质量浓度的增加，COD 降解率变化表现为正峰，蛋白胨质量浓度为4.0 mg/mL 左右时，COD 降解率达到高值。

图4 蛋白胨质量浓度和接种量对COD 降解率的影响Fig.4 Influence of peptone concentration and inoculum on COD degradation rate

图5 蛋白胨质量浓度和葡萄糖质量浓度对COD 降解率的影响Fig.5 Influence of peptone and glucose concentration on COD degradation rate

图6 接种量和葡萄糖质量浓度对COD 降解率的影响Fig.6 Influence of inoculum and glucose concentration on COD degradation rate

图5 为蛋白胨质量浓度和葡萄糖质量浓度对COD 降解率影响的响应面图。图5（a）曲面坡度陡峭，表明蛋白胨质量浓度和葡萄糖质量浓度对COD 降解率的影响较大。图5（b）表明在实验设定范围内，当蛋白胨质量浓度不变时，随葡萄糖质量浓度升高，COD降解率呈现明显升高再缓慢下降的趋势，在葡萄糖质量浓度为9.0 mg/mL 左右达到COD 降解率高值；当葡萄糖质量浓度不变，随蛋白胨质量浓度升高，COD 降解率先升高，在蛋白胨质量浓度为4.0 mg/mL 左右，达到COD 降解率高值，然后开始出现下降趋势。

图6 为接种量和葡萄糖质量浓度对COD 降解率影响的响应面图。由图6（a）三维图凸起程度可以看出，葡萄糖比接种量对应的曲面稍微陡峭，说明葡萄糖质量浓度对COD 降解率的影响大于接种量对COD降解率的影响。图6（b）中等高线近乎呈圆形，表明接种量和葡萄糖质量浓度两因素交互作用不明显。图6（b）表明在实验设定范围内，当接种量不变时，随着葡萄糖质量浓度增加，COD 降解率先升高，在葡萄糖质量浓度为9.0 mg/mL 左右时COD 降解率开始降低；当葡萄糖质量浓度恒定时，随接种量增加，COD 降解率先升高，在接种量为6%左右开始呈现下降趋势。

2.3.5 模型的验证

由响应面图的最高点可看出，在所选的范围内存在极大值点，说明它不仅是响应面的最高点，也是等高线的圆心处。通过软件的进一步分析计算，得到最大响应值所对应的各因素的编码值分别为蛋白胨质量浓度4.3 mg/mL、接种量6.44%、葡萄糖质量浓度9.2 mg/mL，即在此最优条件下，菌株TJPU02 对垃圾渗滤液COD 的去除率可达到的最大理论值为85.95%。为验证模型的可靠性，采用上述最优条件重复做3 次验证实验，所得COD 降解率的均值达到85.76%，与理论预测值相近，说明该模型能真实地反映各筛选因素的影响[22]。因此，用响应面法优化菌株TJPU02 对垃圾渗滤液COD 的降解条件是有效可行的。

3 结 论

（1）本文采用天津市北辰区双口生活垃圾卫生填埋场土样，筛选培育出适于降解垃圾渗滤液的菌株，经分子生物学鉴定为镰刀菌（Fusarium chlamydosporum），命名为Fusarium chlamydosporum TJPU02。

（2）通过Plackett-Burman 实验，筛选出影响菌株TJPU02 降解垃圾渗滤液的3 个显著因素：蛋白胨质量浓度、接种量和葡萄糖质量浓度，显著性顺序为：葡萄糖质量浓度＞接种量＞蛋白胨质量浓度。

（3）通过最陡爬坡法有效地接近最大响应值区域后，采用响应面法建立以COD 降解率为响应值的二次回归方程模型，最终得到菌株TJPU02 降解垃圾渗滤液的最优条件为：蛋白胨质量浓度4.3 mg/mL、接种量6.44%、葡萄糖质量浓度9.2 mg/mL，在最优条件下理论COD 降解率可达85.95%。在此条件下进行验证实验，所得COD 降解率的均值为85.76%，与理论值相近。

（4）本文所筛选的优势菌株Fusarium chlamydosporum TJPU02 对垃圾渗滤液具有显著降解效果，在处理垃圾渗滤液方面具有广阔的应用前景和重要的现实意义。