应用ReCell技术移植治疗稳定期白癜风的临床疗效观察

罗 卫，陈 杰，徐 劲，蔡瑞康

白癜风是一种皮肤获得性色素脱失性疾病，其基本病理变化为皮损部位的黑素细胞数目的减少或消失，自体黑素细胞移植是一种有效的治疗方法。ReCell技术是一项源自澳洲的表皮细胞移植技术，其原理是通过酶解和物理等作用，将小面积的皮片直接处理成表皮细胞混悬液，从而开展各项用途的细胞移植疗法。本研究应用ReCell技术将发疱壁制成表皮细胞混悬液，将含有黑素细胞的表皮细胞混悬液直接种植于白斑皮损创面，观察和研究移植治疗后取得的临床效果。

1 对象与方法

1.1 对象 选择2015-07至2017-07我中心白癜风专科门诊确诊的白癜风患者21例，均为稳定期白癜风患者；其中男12例，女9例；年龄15～35岁，平均22.30岁；病程1～18年，平均6.58年；共选择自体表皮移植皮损33块，其中面部6块，颈部2块，上胸8块，背部3块，腹部3块，上肢5块，下肢6块；白斑皮损最大面积38.67 cm2，最小为5.47 cm2。患者均签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会讨论通过。

1.2 方法

1.2.1 选取供皮 按照供皮区与移植区1∶2原则，供皮区选择皮肤色素正常的非暴露部位(腹部、大腿内侧)，75%乙醇消毒后，使用加温负压表皮细胞分离机(工作负压-50 kPa，温度45 ℃，吸盘孔径1 cm)，于供皮区采用负压和加温双重机制吸疱30～50 min，使表皮分离产生水疱，沿水疱边缘将表皮剪下备用。

1.2.2 含黑素细胞的表皮细胞混悬液的制备 将取下的疱壁置入ReCell试剂盒中的温控容器内，在37 ℃恒温下酶解15～20 min，将疱壁放入缓冲液中和，应用手术刀片在疱壁的表皮侧刮取细胞，形成混悬液，将获得的混悬液缓慢注入过滤器纯化，获得所需的表皮细胞混悬液,主要含角质形成细胞和黑素细胞。

1.2.3 黑素细胞的鉴定 用倒置显微镜观察培养细胞形态。多巴胺染色，将细胞接种于明胶处理的载玻片上，培养至70%融合，将细胞用冷甲醇固定，在0.1%左旋多巴磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中， 37 ℃温育，观察细胞显色程度。

1.2.4 移植治疗 白斑区采用1%利多卡因局部麻醉，用皮肤磨削机打磨白斑区表皮至出现针尖样出血点，将制备好的表皮细胞混悬液分别喷洒接受种植皮损创面，油纱覆盖于种植皮损创面，平纱轻加压包扎，7 d后除去包扎纱布。

1.3 观察指标 观察皮损移植后复色情况，根据中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会色素病学组制定的《白癜风临床分型及疗效标准》(2003年修订稿)[4]。皮损处复色率分为5级：0级为无色素再生或范围扩大，1级为色素恢复1%～25%，2级为色素恢复26%～50%，3级为色素恢复51%～75%，4级为色素恢复76%～100%。

1.4 随访周期 白癜风靶皮损移植后1、3、6个月进行连续性随访观察，按照观察指标进行移植治疗前后的对比分析。

2 结 果

2.1 黑素细胞观察结果 倒置显微镜下典型的黑素细胞形态，主要呈纺锤状两极型细胞(图1A)，多巴胺染色显示细胞质呈棕色或黑灰色(图1B) 。

2.2 移植效果 移植部位7～10 d皮肤创面愈合。术后1个月移植部位变红，有轻微色素沉着。移植区边缘与正常皮肤交界处有浅白色分界线。移植后3～5个月色素明显加深，与周围正常皮肤相比较深或稍浅，边界消失。6个月色素恢复稳定，且颜色与邻近正常皮肤接近(图2)，未见瘢痕和其他不良反应。白癜风皮损移植后1、3、6个月的复色情况统计见表1，移植后6个月的3、4级复色率达87.09%。从移植部位与效果看，下肢、躯干、面部着色均匀，效果较好。颈部、眼睑、嘴唇等活动区域部分出现着色不匀，但均有色素岛形成。处于暴露部位的移植区着色较快。

2.3 不良反应 随访期间， 2例在移植治疗6个月后因出国等原因失访。患者在治疗与随访期间均未发生不良反应，也无皮肤感染、无瘢痕形成等。

图2 白癜风移植前后对比

时间1个月3个月6个月移植皮损/块3333314级9(27.27)14(42.42)15(51.61)3级9(27.27)11(33.33)10(35.48)2级6(18.18)4(12.12)2(3.23)1级4(12.12)2(6.06)2(3.23)0级5(15.15)2(6.06)2(6.45)

注：1-3个月随访21例，6个月随访19例

3 讨 论

由于皮损部位黑素细胞数目的减少或消失，导致的皮肤获得性色素脱失性疾病为白癜风，自体黑素细胞移植是一种有效的治疗方法[1]。自体移植，包括自体表皮直接移植、自体表皮细胞混悬液和自体黑素细胞体外培养移植[2]。由于自体表皮直接移植受到皮肤来源的限制，导致移植的面积较小，并且移植后容易出现色素融合不均等现象，而自体黑素细胞体外培养移植由于黑素细胞培养液中含有一些潜在致癌因子，因此在临床应用过程中存在安全性问题有待进一步研究和观察。

ReCell技术是一项新的表皮细胞移植技术，其原理为通过酶解、物理等作用，将小面积的皮片处理形成表皮细胞混悬液，从而开展各项用途的细胞疗法。这种原生态的自体表皮细胞混悬液早期被应用于烧伤创面的治疗，可以促进创面的愈合，减少植皮的面积。由于应用ReCell技术制成的表皮细胞悬液中含有正常的黑素细胞成分，为白癜风移植治疗提供黑素细胞来源，成为研究和探索移植治疗白癜风的新方向，为白癜风的移植治疗开辟了一种新的移植疗法[3]。Wood等[4]发现：通过ReCell技术制成的含有黑素细胞的原生态的自体表皮细胞混悬液，主要含有表皮基底细胞、朗格罕斯细胞、黑色素细胞和成纤维细胞等，黑色素细胞移植存活后，逐步地发挥功能，达到白癜风复色的作用。同时，表皮基底细胞有促进愈合的作用。

由于细胞未经过传代培养或在细胞悬液中添加任何生物添制剂，不会发生移植后潜在癌变和传染病的可能[5, 6]，因此，应用ReCell技术移植治疗白癜风具有安全性的特点[7]。在自体表皮细胞混悬液的过程中，本研究采用皮肤发疱的疱壁作为黑素细胞的来源，避免了手术切除取皮留下皮肤瘢痕的缺点；该治疗方法由于采用的是细胞移植疗法，移植后色素恢复均匀，较以往进行的负压吸疱自体表皮移植相比较，扩大了移植面积，特别是避免了移植区的拼接样外观。另外，该项技术不需要专门的实验室，可在临床上直接操作，并且方法较为简便[4]。

总之，应用ReCell技术将发疱壁制成表皮细胞混悬液，将含有黑素细胞的表皮细胞混悬液直接种植于白斑皮损创面，进行白癜风的移植治疗具有安全性可靠、供皮区不留瘢痕、移植区复色效果好的特点，并且细胞悬液的制备相对简单[8]。因此，应用ReCell技术移植治疗稳定期白癜风值得在临床上推广应用。