HPLC法同时测定逍遥丸中阿魏酸和甘草酸含量探讨

田 洁，孙玉坤，尹 禄，唐 哲，王海鹏

逍遥散出自《太平惠民和剂局方》，后经中药现代化的工艺改造而制成的中成药制剂逍遥丸[1]。功效为调经养血，疏肝理气，临床常用于治疗肝气不舒所致头昏目眩，食欲不振，月经失调，胸胁满胀等[2-4]。逍遥丸的主要成分包括当归、白芍、柴胡、薄荷、白术、茯苓、甘草。市面上与逍遥丸相关的制剂有逍遥胶囊、浓缩丸、逍遥水丸、逍遥片。2015年版《中国药典》对以上剂型的质量控制仅规定检测芍药苷的含量，而对于其他的化学成分却没有相应的检测标准[5]。文献[6-8]报道了对逍遥丸中的主要成分阿魏酸、甘草苷、槲皮素、柴胡皂苷的成分检测。中成药的复方制剂中往往含有多种复杂的化学成分，单一测定其中一种成分，不能客观全面地反映药品质量，应多种成分同时检测。本实验通过对检测条件的优化，建立了HPLC法同时对逍遥丸中阿魏酸和甘草酸两种有效成分含量的测定方法，为逍遥丸的产品质量评价提供有效的试验数据。

1 材料与仪器

Agilent1260高效液相色谱仪、Agilent1260 Infinity 四元泵系统、Agilent1260紫外检测器等购自安捷伦科技有限公司；DP-uw实验室超纯净水器购自北京亚欧德鹏科技有限公司；YZ-250DB型数控超声波清洗器购自上海越众仪器设备有限公司；ES-E110A电子分析天平购自天津市德安特传感技术有限公司；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱购自上海右一仪器有限公司。阿魏酸对照品(批号:110773-201508)和甘草酸对照品(批号:1405-86-3)，均从中国药品生物制品检定所购得；被测样品均为市售的逍遥丸；甲醇和乙腈、色谱纯由sigma试剂公司生产；磷酸、分析纯购自德州润昕实验仪器有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件选择 采用Agilent Zorbax XDB-C18 的色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；梯度洗脱液选用的是乙腈和0.05%磷酸水溶液30∶70(v/v)；流速为1.0 ml/min；检测波长为 278 nm；柱温设为35 ℃；每次注入样品量为10 μl；流动相梯度程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品阿魏酸2.71 mg、甘草酸5.53 mg，置于100 ml 的容量瓶中，然后加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得阿魏酸和甘草酸浓度分别为0.0271 mg/ml、0.0553 mg/ml的对照品溶液，备用。

2.3 供试品溶液的制备 取大约50粒市售逍遥丸(仲景宛西制药股份有限公司，国药准字Z44020869)，于研钵中反复研磨至细粉、收集后精密称取1.0 g粉末置于具塞磨口三角烧瓶中，加入20 ml甲醇溶液摇匀溶解，称定并记录重量后，超声波预处理20 min，取出三角烧瓶，待降至室温，再次称定重量，加入甲醇溶液补充损失的重量，充分振摇后滤过，滤过液减压干燥，将残渣搜集于10 ml的容量瓶中，加甲醇摇匀、溶解，并定容至刻度，经过微孔滤膜(0.22 μm)滤过，获得的续滤液，即为制备的供试品溶液，备用。

2.4 阴性对照溶液的制备 在逍遥丸的配方组成中除去甘草、当归两味中药成分，将柴胡、白芍、白术、茯苓、薄荷，按照5∶5∶5∶5∶1比例经煎煮、滤过、干燥等工艺处理，制成逍遥丸阴性样品，取其适量阴性样品参照“2.3”项处理方法制备阴性对照品溶液。分别取10 μl对照品、供试品和阴性品三种溶液注入高效液相色谱仪中，应用本文给出的色谱条件对试品进行测定并绘制各自的色谱图。对得出的三幅色谱图进行分析比较，发现阴性对照品溶液在相应的保留时间处没有出现对照品成分吸收峰，说明阴性对照品溶液无干扰(图1)。

图1 逍遥丸HPLC色谱图

2.5 标准曲线的考察 精密吸取“2.2”项下制备的两种样品的对照品溶液各2、4、7、10、15、22 μl，依次注入高效液相色谱仪中，根据前文给出的色谱条件测定两对照品峰面积值，以峰面积值为纵坐标(Y)，以对照品进样量为横坐标(X)进行线性回归，得阿魏酸回归方程：Y=1.537×106X-31851，r=0.9995，其进样量在0.054～0.596 μg与峰面积线性关系良好；甘草酸回归方程：Y=29058X+3128，r=0.9993，其进样量在0.110～1.217 μg与峰面积线性关系良好。

2.6 仪器精密度试验 精密量取10 μl“2.3”项下制备的供试品溶液，在上述色谱条件下，分6次连续注入高效液相色谱仪中，详细记录各自峰面积并计算RSD值，得阿魏酸的RSD值为0.63%，甘草酸的RSD值为0.88%，表明本实验所应用的器材具有良好的精密度。

2.7 试品稳定性试验 量取“2.3”项下相同批号逍遥丸制备的供试品溶液，从0 h起每2 h注入样品1次，共测7次，详细记录各自峰面积变化，并根据峰面积计算RSD值，求得阿魏酸峰面积RSD值为0.53%，甘草酸峰面积RSD值为1.02%，结果表明供试品溶液至少在12 h内具有良好的稳定性。

2.8 重复性试验 量取“2.3”项下相同批号逍遥丸制备的供试品溶液6份，精密量取10 μl溶液在上述色谱条件下依次注入高效液相色谱仪中检测。通过计算得阿魏酸平均质量RSD值为1.35%，甘草酸平均质量RSD值为1.61%，结果表明此方法具有良好的重复性。

2.9 加样回收率试验 取同一批号(批号Z44020869)市售逍遥丸制剂，含量明确，置于研钵中研细混匀，平均分成6等份，每份取约1.0 g，精密称定，置于容量瓶中，将“2.2”项下制备的对照品溶液各取10 ml分别加入6个容量瓶中，依照上述供试品溶液制备方法处理，得加样回收率试品溶液。分别精密量取10 μl溶液依次注入色谱仪中，根据测定结果，计算阿魏酸和甘草酸两种成分的加样回收率、平均加样回收率和RSD值(表2)。

表2 逍遥丸中阿魏酸、甘草酸回收率试验表

2.10 样品的测定 适量称取市售逍遥丸样品6个批次(仲景宛西制药股份有限公司)，按上述对照品溶液制备方法制备样品供试液，分别精密量取10 μl进样测定并记录峰面积，计算阿魏酸和甘草酸的含量，见表3。

表3 6个批次逍遥丸样品含量测定结果

3 讨 论

通过查阅文献资料发现，在供试品溶液制备中，对提取溶剂选择，提取方法与时间优化，以甲醇超声和甲醇加热回流的提取方式进行对比，发现甲醇超声提取法的效率高于加热回流法，料液比也更加经济。在甲醇超声提取时间的考察中，分别选取10、20、30、40 min时间点，结果以20 min为最佳，更长时间不能明显提高效率，而且浪费时间。

在梯度洗脱液的选择上，本研究分别考察了甲醇/水、甲醇/磷酸、乙腈/水、乙腈/磷酸四种配比组合，结果发现逍遥丸的主要成分洗脱与洗脱液的pH值关联较大，甲醇/水、甲醇/磷酸、乙腈/水均不能达到较好的洗脱效果，通过进一步优化，最终选取乙腈/磷酸(0.05%)作为流动相，可使逍遥丸中阿魏酸和甘草酸两种检测成分得到良好的分离效果，呈现较好的色谱图。近年来，已有文献报道同时检测逍遥丸中多种成分的研究，在测定多种成分时，对色谱条件的选择提出了更高要求，每种成分的分离及检测条件很难达到均衡统一，需要设置多种实验条件，也就增加了检测的复杂性。

通过各项条件优化等措施，笔者建立了一套同时对逍遥丸中阿魏酸和甘草酸的含量检测方法，此方法虽然检测的成分较少，但两种物质的最大吸收值相近，选择一种检测波长就可达到较好的响应值，因此具有操作简单、灵敏，结果准确、重现性良好等优点，可为市售逍遥丸的质量控制提供相关依据。