小分子热休克蛋白在宰后牛肉成熟中的作用

黄 峰 ， 丁振江 ， 孙红霞 ， 张春江 ， 张 良 ， 张 泓 *

（1.中国农业科学院 农产品加工研究所（北京），北京100193；2.中国农业科学院 合肥食品营养与健康创新研究院，安徽 合肥 238000；3.中国农业科学院 农产品加工研究所（哈尔滨），黑龙江 哈尔滨 151900）

动物品种、性别、肌肉的部位和营养情况等都可以影响肉的嫩度，但本质上影响嫩度改善的因素主要包括结缔组织含量、肌节长度和肌原纤维蛋白的水解程度3个方面[1]。结缔组织的含量主要影响肉的“本底硬度”，肌节长度主要在僵直过程中对肉嫩度产生影响，而肌原纤维蛋白的有限降解是成熟过程中肌肉嫩度得到改善的主要原因。目前，控制宰后嫩化的方法主要有化学、物理、生物和酶类嫩化法等，其中钙激活酶体系是酶类嫩化法的主要研究对象[2]。钙激活酶被认为是宰后肌肉成熟过程中发挥关键作用的内源酶类[3-4]。但最近研究发现除钙激活酶外，细胞凋亡酶也参与了宰后肌肉的嫩化过程，成熟是多种内源酶和调控因子协同作用的结果[5-7]。热休克蛋白作为一种机体保护蛋白，在动物被屠宰放血后，正常的生理状态被打破，促使机体释放热休克蛋白而产生免疫应答。随着蛋白质组学技术在肉品中的应用，许多的小分子热休克蛋白（small heat shock proteins，sHSPs） 在宰后肌肉中被检测到，并发现与宰后肌肉嫩度、保水性等食用品质变化具有显著相关性，并被认为可能是宰后肌肉成熟过程中的一个重要调控因子[8-9]。作者主要对小分子热休克蛋白的种类、结构与功能及对宰后肌肉成熟过程的调控机制进行探讨。

1 小分子热休克蛋白的种类与结构

热休克蛋白是指生物体遭受外界高于其正常生长温度或剧烈震动时，新合成或过表达的一类保护机体自身的蛋白质，又称为胁迫蛋白。最早由遗传学家Ritossa[10]在1962年研究果蝇唾液腺时发现。根据单聚体相对分子质量大小和同源程度不同，可将热休克蛋白分为 sHSPs，HSP 60，HSP 70，HSP 90及HSP110五大家族[11]。sHSPs是热休克蛋白的亚单位之一，相对分子质量在12 000～43 000之间，和其他热休克蛋白相比，该类蛋白不需要ATP即能发挥作用。目前已在哺乳动物中发现了11种sHSPs，且在不同组织中表达不同（表1）[4]。Taylor等[12]依据其在组织中的表达把sHSPs分为两类，一类是在所有组织中均表达；另一类是只在特定组织中表达。sHSPs作为一种重要的分子伴侣蛋白，结构上高度保守，在氨基酸序列C末端具有一段由80～100个氨基酸残基组成特定区域，因与 αβ-晶体蛋白具有很高的同源性，所以也称为αβ-晶体蛋白区域[13]。除了一个灵活的C端，sHSPs还有一个连接着一个保守序列区域WDPF的N端[14]。sHSPs在体内以高度有序的寡聚体形式存在，其寡聚体的结构和组成均取决于每个小分子热休克蛋白单体的a-晶体结构以及C端和N端的长度和结构。受到应激反应时，sHSPs会发生解离或聚合，可形成相对分子质量达到2×105～8×105的低聚体复合物，从而发挥其生物学功能。

表1 小分子热休克蛋白家族Table 1 Small heat shock proteins family

2 小分子热休克蛋白的主要生物学功能

2.1 稳定细胞骨架

细胞骨架由微丝、微管和中间纤维构成，小热休克蛋白具有稳定和修复细胞骨架结构的作用。HSP 27和aβ-晶状体蛋白是sHSPs家族中的重要成员，有保护细胞骨架蛋白免受各种应激因素的损伤、防止蛋白变性和使变性的蛋白恢复折叠等作用[15]。肌动蛋白是微丝系统的主要组成部分，肌动蛋白受温度影响较大，在高温下以不溶性形式聚集，破坏细胞骨架；而HSP 27能使不可溶性肌动蛋白转变为可溶性，从而稳定细胞骨架[10]。此外，强氧化刺激通过产生ROS破坏细胞中的微丝系统，并导致肌动蛋白的解聚和片段化，而HSP 27可以通过抑制ROS的产生而保护细胞骨架[17]。

2.2 分子伴侣功能

分子伴侣作用是指能够结合或释放其他蛋白质的不稳定构象，使得多肽链可以进一步的折叠，多聚体的组合或降解以及细胞器蛋白跨膜转运的一种功能[18]。虽然sHSPs在哺乳动物细胞中的分子伴侣作用机制还未研究清楚，但是sHSPs在细胞中的作用是不可否认的。例如：HSP 27可以与甾体激素受体结合，不仅可以避免不良反应的发生；结合物还可通过激活蛋白酶活性生成超氧化物歧化酶（SOD）等，增强细胞耐热、抗理化反应及抗氧化物损伤的功能；同时可提供结合蛋白，协同参与抗原递呈、加工、“T”细胞导航以及免疫球蛋白装配[19]等作用。HSP 22可与抗凋亡蛋白Bag3（又称Bcl-2 interacting death suppressor）结合形成分子伴侣复合物[20]。HSP 22与HSP 27和其它分子伴侣相互作用，有刺激心肌细胞生存的作用[21]。研究表明，磷酸化程度较低的HSP 27多聚体的分子伴侣作用较强[22]。

2.3 抑制细胞凋亡

1972年Kerr[23]等首次提出细胞凋亡（apoptosis）的概念。细胞凋亡是指机体细胞收到凋亡信号的刺激后，在多个凋亡因子的相互作用下进行信号传导并规律性完成的细胞程序性死亡，不同的凋亡诱导信号所形成的传导途径不同，目前发现的传导途径主要包括死亡受体通路（外通路）、线粒体通路（内通路）和内质网通路[24]。目前已有许多关于热休克蛋白抑制细胞凋亡方面的报道，都是通过某种方式阻断细胞凋亡通路。Mehlen等[25]探究到人类HSP 27表达可抑制Fas受体介导的细胞凋亡通路，即通过封闭接头蛋白Daxx与细胞凋亡信号调节激酶Ⅰ之间的相互作用；Concannon CG等[26]发现HSP 27可以与procaspase-3结合阻碍其活化而抑制细胞凋亡。上述都是由于阻断了细胞凋亡的死亡受体通路即外通路而抑制细胞凋亡。Mehlen等发现sHSPs对肿瘤坏死因子（TNF-a）的作用主要依赖于解毒分子谷胱甘肽（GSH），阻止细胞色素 C（Cytochrome C，Cyt-C）的释放，进而抑制细胞凋亡；Rane MJ等[27]研究发现HSP27可通过调控caspase-9抑制细胞凋亡；Mao[28]报道αβ-晶体蛋白在十字孢碱所致的凋亡过程中与bax，bcl-Xs结合，抑制两者向线粒体的移位，从而起到抑制细胞凋亡的作用。上述都是由于阻断了线粒体通路即内通路而抑制细胞凋亡。

2.4 心脏保护作用

研究表明血浆中HSP B1抗原浓度明显提高主要表现在冠状动脉疾病患者中[29]，且机体血浆中HSP B1抗体浓度与是否患有该疾病及病情严重程度有明显的相关性[30]。在缺血心肌组织中HSP B5表达量明显增高，研究证明影响HSP B5以何种磷酸化形式参与缺血病理过程的因素较多，缺血时间可能是其一。Wang X等[31]研究发现向大鼠体内注射带有HSP B6基因的骨髓间充质干细胞有利于治疗心肌梗死。有实验表明HSP B8的过表达可以增强线粒体产生NO，进而保护心脏[32]。目前HSP保护缺血心肌组织的机制还需进一步研究。

3 小分子热休克蛋白在成熟过程中的作用

3.1 小分子热休克蛋白与宰后牛肉嫩度的关系

随着蛋白质组学技术在肉品中的应用，许多的小分子热休克蛋白在宰后肌肉中被检测到。在哺乳动物中共检测到11种 sHSPs，其中HSP 27、HSP 20和αβ-晶体蛋白在骨骼肌中的表达量最高[8]。Ouali等[33]首次提出小分子热休克蛋白可能对肉品质有影响。各类小分子热休克蛋白可以不同程度的抑制细胞凋亡，并通过分子伴侣作用维持细胞稳定，此外，小分子热休克蛋白还可以延缓肌肉的老化速度、减弱肌原纤维蛋白降解。宰后肌肉中小分子热休克蛋白的表达和对肉品质的影响机制还有待研究。

在嫩度预测因子的研究中发现HSP 27及其降解产物的含量可解释91%的嫩度变化，高于之前发现的最高嫩度预测因子琥珀酸脱氢酶解释的57.8%嫩度变化[34]，因此，被许多学者认为HSP 27是最有可能参与嫩化过程的热休克蛋白。目前，针对sHSPs的表达与宰后牛肉的嫩度的关系，有两种对立的看法。Kim等[35]在宰后牛肉中发现HSP 27的表达与宰后牛肉嫩度之间存在正相关。Bernard等[36]研究表明由于sHSPs的分子伴侣作用，HSP 27和αβ-晶体蛋白的共同调节有利于肌动蛋白和肌球蛋白的降解，进而提高肉的嫩度。Morzel等[35]也发现HSP 27的表达与宰后牛肉嫩度之间存在正相关，并认为HSP27可能是因为抑制蛋白聚集，从而有利于肌原纤维蛋白的降解，最终提高了宰后牛肉嫩度。相反，Lomiwes等[37]在不同嫩度的牛肉中发现HSP 27表达量显著不同，HSP 27含量越高的牛肉其嫩度越差。Balan等[38]在宰后牛肉中发现HSP27发生降解，且降解程度显著相关与肌间线蛋白和肌钙蛋白-T的降解，并推测降解后的HSP27丧失了其保护功能，从而提高内源酶对肌原纤维蛋白的水解能力。

3.2 sHSPs调控宰后牛肉嫩度的潜在机制

Bernard等[39]认为HSP 27可以和αβ-晶体蛋白、HSP B8相互作用而影响宰后肌肉的嫩度。有研究表明HSP 27的下调会导致肌动蛋白的聚合，提高肌动蛋白微丝的稳定性，而肌动蛋白和肌球蛋白的降解和宰后肌肉的嫩度有密切联系，推测肌动蛋白和肌球蛋白的降解影响肉的质地，肌动蛋白的降解有利于宰后肌肉的嫩化，并且发现肌球蛋白轻链II和磷酸丙糖异构酶I也和肌肉嫩度有明显的联系。此外，HSP 27也是一种抗细胞凋亡蛋白，可以和细胞凋亡信号通路的关键控制蛋白结合，通过影响细胞凋亡的进程进而影响宰后肌肉的嫩度。

研究表明：pH值从7.4降低到6.5，会伴随着αβ-晶体蛋白和肌原纤维蛋白的结合程度增加，也意味着肌肉中sHSPs浓度的降低是和结合肌原纤维蛋白有关联[40]。通过体外模拟实验，将αβ-晶体蛋白添加到肌原纤维蛋白提取物中会降低肌间线蛋白和肌联蛋白的降解，进一步可以说明αβ-晶体蛋白可以作为μ-钙激活酶的底物，并竞争性的抑制μ-钙激活酶的活性[41]，进而影响肉的嫩度，而αβ-晶体蛋白对宰后肌肉嫩化的作用机制还有待研究。

3.3 pH值对sHSPs调控作用的影响

最近的研究还发现宰后肌肉的极限pH值（pHu）与HSP表达及嫩度变化相关，Pulford等[41]认为pHu的降低会导致HSP 20、HSP 27和 αβ-晶体蛋白在肌肉中的浓度降低，并且在处于中间pHu的宰后肌肉中可以检测出sHSPs，在低pHu或高pHu条件下，只能检测出很少的sHSPs，推测损失的部分sHSPs是由于生成了由磷酸化或脱磷酸化的sHSPs、ATP以及信号传导等控制的低聚体络合物。pHu在5.8～6.0之间牛肉其嫩度较其他pH范围的差，这种嫩度差异可能是由于pH改变了HSP 27对钙激活酶的水解活性，最终造成钙激活酶对肌原纤维蛋白的水解程度不同所造成[37，42-43]。也有学者推测在中间pHu，内源性蛋白水解活动和高浓度sHSPs的共同作用会稳定肌原纤维蛋白，并阻碍肌原纤维蛋白的水解，进而降低肉的嫩度[43]。此外，Lomiwes等[43]研究表明高pHu条件下的sHSPs浓度高于低pHu条件下sHSPs的浓度，尽管如此，在高pHu条件下，sHSPs也会随着肉品质的成熟发生降解，可能是由于在此pH是μ-钙激活酶的最佳活性条件。另外，许多学者利用蛋白质组学在宰后肌肉中检测到HSP 27不同等电点的异构体[44]，而磷酸化作为改变蛋白等电点的一种常见方式值得关注。

4 展望

目前有关热休克蛋白27在细胞培养或在病理状态下（如神经肌肉失调、肌炎、肌萎缩等）下的调控机制研究已相对成熟。许多学者最近发现热休克蛋白27与宰后肌肉嫩度之间存在显著相关性，但对这种相关性的内在机制存在两种推测：一是HSP 27由于降解或沉淀丧失保护功能，从而提高内源酶水解能力；另一种是HSP 27可能抑制肌肉蛋白聚集更有利于其降解。目前有关HSP 27在宰后嫩化过程中的调控机制研究还较少，直接的支撑数据更是有限，特别是宰后肌肉嫩化过程中HSP 27对肌原纤维蛋白、细胞凋亡酶和钙激活酶的结构修饰及修饰后肌原纤维蛋白对肌肉内源酶水解敏感性变化以及修饰后钙激活酶或细胞凋亡酶酶对肌原纤维蛋白的水解活性变化等。因此，热休克蛋白27在宰后肌肉嫩化过程中的调控机制有待深入研究，从而丰富和发展肉的嫩化理论，进一步完善嫩化过程中的内源酶调控网络提供新的理论依据。