肉豆蔻-8散通过JAK2/STAT3信号通路减轻缺氧/复氧心肌细胞的损伤

钱新宇，肖云峰，王玉华，杨秀华，王 娜

(内蒙古医科大学 1药学院;2新药安全评价研究中心,呼和浩特 010010)

在全球范围内，缺血性心脏病(ischemic cardiomyopathy，ICM)的发病率和病死率不断增加。缺血性心脏病是指由冠状动脉粥样硬化引起的长期心肌缺血，从而导致心肌弥漫性纤维化临床综合征。而再灌注治疗是目前治疗缺血性心脏病最有效的治疗策略。然而当缺血组织恢复灌注后，会发生代谢功能障碍和结构损伤。这种现象称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。MIRI会影响治疗效果，增加恶性心律失常和心脏猝死等严重并发症的发生风险[1-2]。在MIRI期间，线粒体氧化损伤会增加线粒体氧化应激从而加剧心肌损伤。线粒体氧化损伤导致线粒体结构及功能发生一系列变化，如线粒体通透性改变，线粒体肿胀和促凋亡蛋白的释放[3]，从而导致线粒体功能障碍，离子稳态失衡及收缩功能障碍，最终引起心肌细胞凋亡和坏死。因此，保护线粒体免受氧化损伤可能是改善MIRI的合理方法之一[4]。

肉豆蔻-8散是由肉豆蔻、沉香、丁香、广枣、木香、旋覆花、阿魏和牦牛心八味蒙药组成，该方最早被经典医学著作《普济方集》[5]收录，目前该方被《内蒙古蒙药制剂规范》[6]第二册所收录。该方应用于蒙药临床已超过两百多年，通常用于心烦、气短、心供血不足、风湿性心脏病等。本课题组前期研究发现，肉豆蔻具有抗心肌缺血[7]和抗氧化作用[8]。因此，肉豆蔻-8散减轻MIRI可能与抑制线粒体氧化损伤有关。此外，本课题组还用外标法测定了肉豆蔻-8散提取物主要成分的含量，其包括丁香酚(10.755 8 mg/g)、去氢木香内酯(2.041 8 mg/g)、木香烃内酯(1.691 5 mg/g)、鞣花酸(0.690 4 mg/g)和去氢二异丁香酚(0.189 3 mg/g)等。

JAK2/STAT3是调节细胞存活和细胞功能的重要信号通路，与心肌细胞损伤密切相关。此外，JAK2/STAT3信号的激活可以减少氧化应激[9]并维持线粒体功能[10]。然而，肉豆蔻-8散是否可以通过JAK2/STAT3信号通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤尚未阐明。因此，本研究旨在探讨肉豆蔻-8散对MIRI心脏的保护作用和肉豆蔻-8散对线粒体功能的影响。同时探究这些作用是否与JAK2/STAT3信号通路有关。

1 材 料

1.1 细胞及试剂

H9c2心肌细胞(上海富恒细胞库)；肉豆蔻-8散(内蒙古医科大学药学院制备)；连二亚硫酸钠(天津永晟精细化工有限公司)；CCK-8、细胞裂解液(武汉博士德生物工程有限公司)；Hoechst(上海碧云天生物技术公司)；AG490，β-actin，AG490阻断剂(纯度大于99%)，JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Bax、Bcl-2一抗(英国Abcam公司)；胰蛋白酶、DMSO(北京索莱宝技术有限公司)；DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸转氨酶(AST)检测试剂盒(宁波美康生物科技股份有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；山羊抗兔二抗(美国Abbkine公司)。

1.2 仪 器

倒置式生物显微镜(德国Leica公司)；全自动酶标仪(美国赛默飞世尔仪器有限公司)；紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；台式高速冷冻离心机(德国Sigma公司)；全自动生化分析仪(爱尔兰Sapphire公司)；电泳仪(美国Bio-Rad公司)；红外激光成像系统(美国LI-COR公司)。

2 方 法

2.1 肉豆蔻-8散及提取物的制备

通过文献[6]中肉豆蔻-8散处方进行制备，药材均购自内蒙古医科大学附属医院中药房，由内蒙古医科大学渠弼教授鉴定。选取肉豆蔻、沉香、丁香、广枣、木香、旋覆花和阿魏各250 g，以及牦牛心150 g，以上八味药材，粉碎成细粉，过筛，混匀，分装，保存备用。

称取肉豆蔻-8散10.0 g，精密称定，置于500 mL圆底烧瓶中，加入75%乙醇250 mL，加热回流提取30 min，提取2次，合并滤液，蒸干，得到肉豆蔻-8散提取物5 g。称取一定量的肉豆蔻-8散提取物，首先用DMSO溶解至一定浓度，然后用DMEM稀释至相应浓度么，最后用0.22 μm微孔滤膜除菌，4 ℃保存备用。

2.2 AG490阻断剂的制备

称取AG490阻断剂2.95 mg，精密称定，置于棕色玻璃小瓶中，加入DMSO 100 μL，使用涡旋仪将其完全溶解，加入无血清培养液900 μL，配成10 mmol/L AG490阻断剂。使用0.22 μm微孔滤膜除菌，-20 ℃保存备用。

2.3 分组及给药

实验共分为6组，空白组使用无血清培养液培养36 h，换为无血清培养液继续培养1 h后使用无血清培养液继续培养3 h；模型组使用无血清培养液培养36 h，换为终浓度为2 mmol/L Na2S2O4的无血清培养液继续培养1 h后使用无血清培养液继续培养3 h；AG490阻断剂组加入终浓度为40 mg/L肉豆蔻-8散提取物及1 mol/L AG490阻断剂的无血清培养液培养36 h，换为终浓度为2 mmol/L Na2S2O4的无血清培养液继续培养1 h后使用无血清培养液继续培养3 h；肉豆蔻-8散提取物低剂量组加入终浓度为10 mg/L含肉豆蔻-8散提取物的无血清培养液培养36 h，换为终浓度为2 mmol/L Na2S2O4,的无血清培养液继续培养1 h后使用无血清培养液继续培养3 h；肉豆蔻-8散提取物中剂量组加入终浓度为20 mg/L含肉豆蔻-8散提取物的无血清培养液培养36 h，换为终浓度为2 mmol/L Na2S2O4,的无血清培养液继续培养1 h后使用无血清培养液继续培养3 h；肉豆蔻-8散提取物高剂量组加入终浓度为40 mg/L含肉豆蔻-8散提取物的无血清培养液培养36 h，换为终浓度为2 mmol/L Na2S2O4,的无血清培养液继续培养1 h后使用无血清培养液继续培养3 h。

2.4 CCK-8法检测细胞活力

取生长状态良好的H9c2细胞。消化后以每孔1×104个细胞接种于96孔板上。根据实验要求进行分组，完成相应处理后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育1 h，使用酶标仪在450 nm处检测吸收度，计算细胞活力，实验平行测定3次。

2.5 Hoechst染色法

取生长状态良好的H9c2细胞，消化后以每孔1×105个细胞接种于24孔板上。根据实验要求进行分组，完成相应处理后，每孔加入Hoechst 33342染液250 μL，避光培养30 min，弃去染色液，PBS清洗3次，每次1 min。使用荧光显微镜观察细胞凋亡情况。

2.6 生化指标的检测

2.6.1 细胞培养液中LDH、CK、AST 含量的检测 取生长状态良好的H9c2细胞，消化后以每孔6×105个细胞接种于6孔板上。根据实验要求进行分组，完成相应处理后，收集细胞培养液。1 000 r/min，离心7 min，吸取上清液。使用全自动生化分析仪进行检测LDH、CK和AST水平，实验平行测定6次。

2.6.2 细胞中CAT、SOD、GSH-Px含量的检测 取生长状态良好的H9c2细胞，消化后以每孔6×105个细胞接种于6孔板上。根据实验要求进行分组，完成相应处理后，弃去细胞培养液，使用细胞裂解液收集各组细胞。BCA蛋白定量法测定各组蛋白浓度，进而根据试剂盒操作说明书测定细胞中CAT、SOD、GSH-Px水平，实验平行测定3次。

2.7 蛋白免疫印迹法(Western blot)

取生长状态良好的H9c2细胞，消化后以每孔6×105个细胞接种于6孔板上。根据实验要求进行分组，完成相应处理后，使用细胞裂解液提取各组细胞蛋白，BCA蛋白定量法测定细胞蛋白浓度，在样品中加入5×蛋白质上样缓冲液使用100 ℃金属浴加热10 min进行蛋白变性；按照SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒说明书进行SDS聚丙烯酰胺凝胶的制备；以80 V，30 min电泳浓缩胶，以120 V，90 min电泳分离胶，当指示带电泳至分离胶底部停止电泳；转膜2 h至PVDF膜上，使用Western blot封闭液封闭10 min；一抗(β-actin，JAK2，p-JAK2，STAT3，p-STAT3，Bax，Bcl-2，1∶1 000)4 ℃孵育过夜；使用TBST清洗3次，每次10 min，二抗(1∶5 000)摇动孵育1 h；TBST清洗3次，使用红外激光成像系统进行检测，Image J软件获得灰度，实验平行测定3次。

2.8 统计学分析

3 结 果

3.1 Na2S2O4诱导心肌细胞缺氧/复氧损伤模型的建立

实验结果显示，与空白组比较，不同浓度的Na2S2O4均可显著降低细胞存活率(P<0.01)，并随Na2S2O4剂量增大，H9c2心肌细胞存活率不断下降，其中Na2S2O4对H9c2细胞活力的半数抑制量为2 mmol/L。因此，选择2 mmol/L Na2S2O4作为心肌细胞缺氧/复氧损伤模型。结果见图1。

Figure1 Effects of different concentrations of sidoum dihionite on myocardial cell viability

##P<0.01vscontrol group

3.2 肉豆蔻-8散提取物对Na2S2O4诱导心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响

实验结果显示，与模型组比较，不同浓度肉豆蔻-8散提取物均可显著提高细胞存活率(P<0.01)，并随肉豆蔻-8散提取物剂量增大，H9c2心肌细胞存活率不断提高。其中，肉豆蔻-8散低剂量组(10 mg/L)与肉豆蔻-8散中剂量组(20 mg/L)、高剂量组(40 mg/L)均有显著差异(P<0.01)；肉豆蔻-8散中剂量组与高剂量组有显著差异(P<0.05)；AG490阻断剂组可减弱肉豆蔻-8散提取物的作用，结果见图2。

Figure2 Effects of different concentrations of sidoum dihionite on myocardial cell viability

A:Control；B:Model；C:AG490 blocker;D:Roudoukou-8San(10 mg/L)；E:Roudoukou-8San(20 mg/L);F:Roudoukou-8San(40 mg/L)

##P<0.01vsmodel group；*P<0.05，**P<0.01

3.3 肉豆蔻-8散提取物对心肌细胞形态改变的影响

Hoechst荧光细胞核染色，可直接反映细胞的存活量，其荧光强度可反映细胞的凋亡状态。结果见图3。荧光倒置显微镜下观察，空白组细胞呈均一核染，且未见核异常，结果见图3-A；模型组细胞形态变化明显，细胞出现核破裂、细胞数量变少及细胞核呈碎块状致密浓染等凋亡形态学特征，结果见图3-B；AG490阻断剂组细胞状态与模型组相似，结果见图3-C；肉豆蔻-8散低剂量组(10 mg/L)可见核固缩、核破裂等现象减弱，细胞数量较模型组明显增多，但细胞间隙较大，结果见图3-D；肉豆蔻-8散中剂量组(20 mg/L)可见核固缩、核破裂等现象减弱，细胞数量较模型组明显增多，结果见图3-E；肉豆蔻-8散高剂量组(40 mg/L)可见核固缩、核破裂等现象明显减弱，细胞数量较模型组明显增多，结果见图3-F。

3.4 肉豆蔻-8散提取物对生化指标检测结果的影响

实验结果显示，与模型组比较，不同浓度肉豆蔻-8散组细胞培养液中CK、LDH、AST含量显著降低(P<0.01)，其中，与肉豆蔻-8散低剂量组(10 mg/L)比较，肉豆蔻-8散中剂量组(20 mg/L)和肉豆蔻-8散高剂量组(40 mg/L)细胞培养液中CK、LDH、AST含量显著降低(P<0.01)；AG490阻断剂组可减弱肉豆蔻-8散提取物的作用，结果见表1。

Figure3 Hoechst staining to observe the apoptotic morphology of cardiomyocytes

A:Control；B:Model；C:AG490 blocker;D:Roudoukou-8San(10 mg/L)；E:Roudoukou-8San(20 mg/L);F:Roudoukou-8San(40 mg/L)

GroupCK/(U/L)LDH/(U/L)AST/(μmol/L)Control5.64±1.18##27.83±5.26##5.43±0.73##Model9.46±1.2777.37±8.3813.92±0.16AG490blocker9.53±1.54##71.32±5.74##13.62±0.23##Roudoukou-8San(10mg/L)8.48±1.23##64.45±5.78##11.36±0.22##Roudoukou-8San(20mg/L)7.41±1.24##∗∗47.45±4.78##∗∗7.26±0.48##∗∗Roudoukou-8San(40mg/L)6.54±1.04##∗∗36.57±4.42##∗∗6.21±0.36##∗∗

##P<0.01vsmodel group；**P<0.01vsRoudoukou-8San(10 mg/L) group

实验结果显示，与模型组比较，不同浓度肉豆蔻-8散组细胞中CAT、SOD、GSH-Px含量显著升高(P<0.01)，其中，与肉豆蔻-8散低剂量组(10 mg/L)比较，肉豆蔻-8散中剂量组(20 mg/L)和肉豆蔻-8散高剂量组(40 mg/L)细胞中CAT、SOD、GSH-Px含量显著升高(P<0.01)；AG490阻断剂组可减弱肉豆蔻-8散提取物的作用，结果见表2。

GroupCAT/(U/mgprot)SOD/(U/mgHb)GSH-Px/(U/mgprot)Control7.67±1.65##309.89±21.28##28.83±5.73##Model2.47±0.25172.34±12.988.42±2.16AG490blocker2.93±0.24171.82±13.758.47±2.27Roudoukou-8San(10mg/L)4.26±0.21##207.35±12.98##15.26±1.98##Roudoukou-8San(20mg/L)5.99±1.01##∗∗233.50±19.49##∗∗20.94±1.39##∗∗Roudoukou-8San(40mg/L)6.56±0.69##∗∗285.26±17.69##∗∗27.23±5.18##∗∗

##P<0.01vsmodel group；**P<0.01vsRoudoukou-8San(10 mg/L) group

3.5 肉豆蔻-8散提取物对心肌细胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-JAK2、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

实验结果显示，与模型组比较，不同浓度肉豆蔻-8散组可使p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表达增加(P<0.01)、Bax蛋白表达减少(P<0.01)；其中，与肉豆蔻-8散低剂量组(10 mg/L)比较，肉豆蔻-8散中剂量组(20 mg/L)和肉豆蔻-8散高剂量组(40 mg/L)细胞中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表达增加(P<0.01)、Bax蛋白表达减少(P<0.01)；AG490阻断剂组可减弱肉豆蔻-8散提取物的作用，结果见图4。

4 讨 论

本实验的结果显示，2 mmol/L Na2S2O4可显著降低细胞活力，同时可显著增加LDH、CK和AST的水平，说明本实验的H9c2细胞缺氧/复氧模型建立成功。与模型组相比，肉豆蔻-8散提取物可增加受损细胞的活力、显著降低LDH、CK和AST的水平。故肉豆蔻-8散可减轻MIRI。MIRI的氧化应激增加会造成线粒体氧化损伤，反过来，线粒体氧化损伤又会加剧MIRI。SOD、GSH-Px和CAT是3种重要的抗氧化酶。SOD可阻断氧自由基对细胞的损伤，并且能够及时修复受损的细胞。CAT可将H2O2直接分解为H2O和O2，从而抑制脂质过氧化反应。GSH-Px可维持机体氧化与抗氧化平衡，从而保护细胞膜的结构免受过氧化物损伤。实验结果说明，肉豆蔻-8散可使心肌细胞SOD、GSH-Px和CAT的活性提高，抑制脂质过氧化反应、修复受损细胞。故肉豆蔻-8散可减轻由心肌缺血再灌注损伤造成的氧化损伤，发挥心脏保护作用。

Figure4 Effect ofRoudoukou-8Sanon the protein expression of JAK2,p-JAK2,STAT3,p-STAT3,Bax and Bcl-2 in cardiomyocytes

1:Control；2Model；3:AG490 blocker;4:Roudoukou-8San(10 mg/L)；5:Roudoukou-8San(20 mg/L);6:Roudoukou-8San(40 mg/L)

##P<0.01vsmodel group；*P<0.05，**P<0.01

在这项研究中，肉豆蔻-8散不仅对心肌细胞具有保护作用同时也显著减少模型组p-JAK2和p-STAT3表达，使抗凋亡因子Bcl-2增加和促凋亡因子Bax减少。但这些作用可被JAK2特异性阻断剂AG490消除。Bcl-2和Bax在MIRI的凋亡过程中起重要作用并且是内在线粒体途径的重要组成部分[11]。之前研究已证明，多种药物可作用于JAK2/STAT3信号通路，调节内在线粒体途径进而诱导细胞凋亡[12-14]。故肉豆蔻-8散激活JAK2/STAT3信号通路可促进心肌细胞中抗凋亡信号传导，进而发挥心肌保护作用。

总之，实验结果表明，肉豆蔻-8散可减轻心肌缺血再灌注损伤，对心脏具有保护作用。而这种保护作用主要与JAK2/STAT3信号的激活和线粒体氧化损伤的减轻有关。肉豆蔻-8散可通过激活JAK2/STAT3信号通路减弱MIRI诱导的线粒体氧化损伤。这些结果表明，肉豆蔻-8散可能成为治疗心肌缺血再灌注损伤的有效药物之一。