苦木总生物碱的化学成分分析及其对大鼠胶原诱导性关节炎的作用

刘博文，刘富垒,，王如意，薛经纬，柳文媛，冯 锋,4,5*，曲 玮,5**

(1中国药科大学中药学院天然药物化学系，南京 210009；2山东省泰安市中心医院，泰安 271000；3中国药科大学药学院药物分析系，南京 210009；4江苏食品药品职业技术学院，淮安 223003；5中国药科大学生物材料重点实验室，南京 210009)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性炎症性自身免疫性疾病[1]，该疾病会导致患者关节畸形，活动不便，严重的将导致残疾。类风湿性关节炎的病因多与基因、环境及性别有关[2]，但并未完全阐明。其病理主要表现为关节处滑膜增生、大量炎性细胞浸润、炎性滑膜炎及骨与软骨的破坏等[3]。治疗类风湿性关节炎的药物主要有非甾体抗炎药、糖皮质激素、改善病情类药物(如阿达木单抗、托珠单抗)等[4]。然而，这些药物存在着不良反应大、价格昂贵等缺陷[5-7]，限制了其使用。而一些中药因其为多个天然活性成分间的组合，对一些较为活跃的靶标具有一定的协同作用，因此具有较高药理活性。这些优势使得中药一直是抗类风湿性关节炎药物的研究热点[8]。

苦木[Picrasmaquassioides(D.Don) Benn]是苦木科苦木属植物苦木的干燥枝茎，主要分布在我国南方各省、朝鲜半岛及日本等地。苦木作为一种中药在我国具有悠久的用药历史，功能主治清热解毒、湿热泻痢、毒蛇咬伤等[9-10]。苦木注射液(海立新®)是一种以苦木为单味药的中药制剂，被广泛应用于临床，功能主治感冒、上呼吸道感染、急性扁桃体炎、肠炎等[11]。研究表明，苦木的主要活性成分，β-咔巴啉和铁屎米酮类生物碱，具有良好的抗炎[12]、抗肿瘤[13]及抗高血压[14]等活性。机制研究表明,苦木生物碱具有良好的抗TNF-α和抗IL-6活性[15]，有望成为一种较好的抗类风湿性关节炎的药物。胶原诱导性关节炎(CIA)是RA的动物实验模型。本文主要研究苦木总生物碱对大鼠CIA的作用。

1 材 料

1.1 药品与试剂

苦木药材于2016年购于江西赣州，经冯锋教授鉴定为苦木Picrasmaquassioides(D.Don) Benn的干燥茎，凭证标本均存放于中国药科大学天然药物化学研究室；1-羟甲基-β-咔巴啉，3-甲基铁屎米-5,6-二酮和5-羟基-4-甲氧基铁屎米-6-酮标准品(本实验室从苦木中分离得到，纯度大于98%，通过MS2，1H NMR和13C NMR光谱数据鉴定)；注射用地塞米松磷酸钠(Dex，安徽马鞍山丰原制药有限公司)；DMEM高糖培养基(不含双抗)，胎牛血清(FBS)[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；脂多糖(LPS，碧云天生物技术有限公司)；水合氯醛(纯度大于99.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；牛Ⅱ型胶原及完全弗氏佐剂(美国Sigma公司)；TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒(上海欣博盛生物科技有限公司)；其他化学试剂均为市售分析纯。

1.2 仪 器

高效液相色谱(Aglient 1200分析型液相色谱)，G6538 Q-TOF高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪(HPLC-ESI-Q-TOF-MS)(美国安捷伦公司)；BSA124S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；DM041型台式低速离心机(美国Scilogex公司)；XD-202型光学显微镜(江南光电股份有限公司)；Multiskan FC型酶标仪(赛默飞世尔上海仪器有限公司)；IX5型倒置显微镜(日本Olympus公司)。

1.3 动 物

清洁级SD大鼠，雄性，(180±10) g，由南京青龙山动物繁殖场提供，实验动物生产许可证号为SCXK(苏)2017-0001。动物喂养于中国药科大学动物实验中心，25 ℃分笼饲养，自由饮食饮水，实验室采用12 h光照和12 h黑暗的光暗周期。动物在实验室适应环境1周后进行实验，所有动物实验符合动物伦理委员会标准。

2 方 法

2.1 苦木总生物碱的制备

取风干的苦木茎4.75 kg，粉碎，在回流条件下用80%乙醇水溶液20 L提取两次，每次约2 h，合并两次提取液，旋蒸浓缩得到浸膏119 g。3%～5%的HCl(pH为1～2)1.29 L溶解浸膏，等体积的二氯甲烷萃取3次除去酸不溶性成分，25%的氨水调节pH至9～10，等体积的二氯甲烷萃取生物碱，旋蒸合并二氯甲烷得苦木总生物碱6.55 g，干燥、备用。

2.2 苦木总生物碱的定性定量分析

液质联用色谱条件：Eclipse Plus C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，流动相为乙腈-0.1%甲酸按表1梯度洗脱，流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温40 ℃，波长254 nm。

Table1 HPLC elution time procedure of total alkaloids fromPicrasmaquassioides(TAPQ)

t/minAcetonitrile/%0.1%Formicacid/%018822021794534668040609052489410009810009918821101882

质谱条件如下。离子源：ESI电喷雾离子源；正离子方式检测，扫描方式：全扫描，质量范围m/z100～1 700 Hz，干燥气温度：325 ℃；雾化气压力：40 psi(1 psi=6.895 kPa)；鞘气温度：400 ℃；鞘气流速：10.0 L/min；毛细管电压：3 500 V；碎裂器电压：120 V；碰撞电压：35 V。

定量色谱条件：SepaxGP-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相同表1梯度洗脱，流速1 mL/min，进样量20 μL，柱温40 ℃，波长254 nm。

2.3 体外活性研究

LPS诱导的RAW264.7细胞抗炎活性考察：RAW264.7小鼠巨噬细胞以每孔2.0×104～5.0×104个细胞的密度接种于96孔板中。37 ℃，5% CO2的细胞培养箱内孵育12～24 h，待细胞贴壁后，加入不同药物浓度的DMEM溶液(含10 μg/mL的LPS及10%的FBS)，继续培养24 h，吸取上清液分别用小鼠ELISA试剂盒测量TNF-α及IL-6。抑制率(%)=(对照组吸收度-试验组吸收度)/(对照组吸收度-空白组吸收度)×100。

2.4 模型制备及给药方法

根据文献的方法进行造模[16-17]。将牛Ⅱ型胶原溶解于0.1 mol/L乙酸中，在4 ℃下搅拌过夜，然后将上述乙酸溶液逐滴滴加到等体积的完全弗氏佐剂中，涡旋至均匀的乳化液，最终质量浓度为1 mg/mL。第1天，每只造模大鼠于尾巴基部多点皮内注射牛Ⅱ型胶原100 μg，1周后注射同样的剂量进行一次加强免疫，第11天造模成功开始给药。给药时通过尾静脉注射0.6%吐温-80助溶的苦木总生物碱，低剂量组为0.907 mg/kg，高剂量组为1.814 mg/kg，模型组注射等量的生理盐水(CIA+saline)，阳性药组按照每只50 μg的剂量注射地塞米松(CIA+Dex)，连续给药18 d。每组动物的左足跖体积每2天测量1次，每组动物的关节炎级别分数根据一定的标准每两天记录1次，得出各治疗组关节足跖体积和关节级别分数的折线图。关节炎级别标准如下：“0”无肿胀，局灶性发红；“1”指关节肿胀；“2”脚踝或手腕轻度肿胀；“3”涉及整个爪子的严重炎症；“4”关节畸形或僵直。每次记录两只后腿的关节炎级别分数之和。计算各治疗组的曲线下面积，综合评估各治疗组的治疗效果。

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2.5 血清样本采集及细胞因子含量测定和组织样本采集及组织学观察

大鼠给药18 d后，称重，于股骨动脉取血处死，收集全血，静置30 min后，离心取上清液，置于-80 ℃冰箱保存备用。按照TNF-α和IL-6的ELISA试剂盒说明书操作，检测各组血清中TNF-α和IL-6的含量。迅速剪去左腿踝关节，剥离肌肉和组织，生理盐水洗涤后置于4%多聚甲醛中固定备用。将组织脱钙、包埋、切片，并进行苏木精-伊红(HE)染色，显微镜观察各组的关节处病理变化。

2.6 统计学分析

用Graphpad Prism 5.0软件计算足跖肿胀程度的折线图各治疗组的曲线下面积。

3 结 果

3.1 苦木总生物碱的定性定量分析

通过对苦木总生物碱的HPLC-Q-TOF-MS/MS分析，得出苦木总生物碱的总离子流图(TIC)如图1，大部分的峰具有很好的分辨率和灵敏度。通过查阅文献以及标准品对照分析，从中解析出14个生物碱化合物，为β-咔巴啉类和铁屎米-6-酮类生物碱，其中包括9个生物碱单体及5个生物碱二聚体，其结果如下表2，其结构如图2所示。

苦木总生物碱的液相色谱图及混合标准品的色谱图见图3、图4。在混标谱图中，保留时间在5.743，9.901和33.279 min处的峰依次为1-羟甲基-β-咔巴啉(化合物1)，3-甲基铁屎米-5,6-二酮(化合物3)和5-羟基-4-甲氧基铁屎米-6-酮(化合物9)。含量测定前按照相关文献的要求进行方法学考察[26]。通过液相分析，化合物1，3和9的含量分别为(3.20±0.03)%、(1.32±0.01)%和(12.61±0.05)%。

3.2 苦木总生物碱对LPS诱导RAW264.7抗炎活性

各浓度下苦木总生物碱对LPS诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞中TNF-α和IL-6的抑制作用如图5-A所示。经Graphpad Prism 5.0计算，苦木总生物碱对TNF-α的IC50为(22.880±4.005)μg/mL，对IL-6的IC50为(8.672±0.330)μg/mL。结果表明，苦木总生物碱具有一定的抗TNF-α和IL-6活性。

综上所述，苦木总生物碱显然具有一定的抗炎活性，在较低的质量浓度下(5 μg/mL)与阳性药地塞米松在相同浓度下的抑制活性对比见图5-B，苦木总生物碱与地塞米松都具有较强的抗炎活性，相同剂量下，苦木总生物碱对TNF-α的抑制活性要强于地塞米松。

Figure1 Total ion chromatogram (TIC) of total alkaloids in TAPQ

Table2 Identified information of the compounds in TAPQ

No.tR/min[M+H]+/[M-Cl]+Predictedformula AssignmentRemark11.398199.0862C12H10N2O1-Hydroxymethyl-β-carbolineStandard21.994213.0661C12H8N2O2β-Carboline-1-carboxylicacidStandard32.208251.0801C15H10N2O23-Methylcanthin-5,6-dioneStandard42.470453.3435C27H24N4O3PicrasidinesB[18]52.804241.0972C14H12N2O21-Methenyl--4-methoxyl-β-carboline[19]65.880227.1180C13H10N2O21-Methoxymethenyl-β-carboline[20]77.812255.1129C15H14N2O21-Ethenyl-4,8-dimethoxyl-β-carboline[21]88.742257.1284C15H16N2O21-Ethyl-4,8-dimethoxyl-β-carboline[22]99.910267.0761C15H12N2O35-Hydroxyl-4-methoxylcanthin-6-oneStandard1025.122281.0929C16H12N2O43-Methyl-4-methoxylcanthin-5,6-dioneStandard1137.280481.1864C28H24N4O4PicrasidinesH[23]1246.506449.1981C28H24N4O2ClPicrasidinesGoritsisomers[24]1349.605479.2076C29H26N4O3ClPicrasidinesForitsisomers[25]1453.110509.2188C30H28N4O4ClPicrasidinesSoritsisomers[24]

Figure2 Structures of confirmed compounds in TAPQ

Figure3 HPLC chromatogram of TAPQ (5 mg/mL)

Figure4Mixed HPLC spectra of three standards

3.3 苦木总生物碱对大鼠CIA的作用

如图6所示，根据“2.4”项下给药方法连续给药18 d后，治疗组特别是高剂量组的大鼠足跖肿胀程度明显降低。高剂量治疗组与生理盐水组的治疗效果在即将结束的第13～17天具有显著性差异(图6)。在足跖肿胀程度的折线图中(图6-A)，由Graphpad Prism 5.0计算的各治疗组曲线下面积可知，5个治疗组关节肿胀体积与x轴的曲线下面积(AUC)分别为空白组为23.02，生理盐水组为50.89，高剂量组为38.15，低剂量组为47.08，阳性药地塞米松组为34.45。由此可知，苦木总生物碱能够显著降低发炎关节的肿胀程度，特别是高剂量组拥有与阳性药相媲美的治疗效果，其对关节肿胀具有明显的缓解作用。

#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001vscontrol group；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vsmodel group (CIA+saline)

如图7所示，生理盐水组与空白组相比，血清中的TNF-α和IL-6的含量较高，具有一定的显著性差异，说明模型组动物处于很严重的炎症状态。由给药组血清中的TNF-α和IL-6的含量可知，无论是低剂量还是高剂量组，血清中的炎症因子含量显著降低，与生理盐水组相比都有显著性差异，说明苦木总生物碱特别是高剂量组能够显著降低类风湿性关节炎大鼠体内的TNF-α和IL-6两种炎症因子含量。因此，苦木总生物碱具有很强的体内抗炎活性，拥有抑制类风湿性关节炎疾病进展的内在潜力。

##P<0.01,###P<0.001vscontrol group；**P<0.01,***P<0.001vsmodel group (CIA+saline)

各治疗组对关节炎的治疗效果，还需对关节的病理特征做进一步研究，本实验着重考察苦木总生物碱是否能够抑制类风湿性关节炎的关节侵蚀与破坏。各治疗组的关节照片和切片的HE染色分析如图8所示。直观的关节照片如图8-A所示，空白组、模型组和各给药组的照片可以直观地反映各组的关节状态，模型组肿胀明显，关节发生僵直，符合类风湿性关节炎的体外特征，其他各治疗组肿胀程度明显减弱。踝关节的HE染色切片结果如图8-B所示，模型组大鼠的关节处有很严重的炎性细胞浸润，滑膜及软骨都有很大程度的破坏，而给药组特别是高剂量组的滑膜破损的程度很小，仅有少量的炎性细胞浸润，展现出几乎完整的关节滑膜。可见，苦木总生物碱(尤其在1.814 mg/kg的剂量下)具有一定的抑制关节处炎性细胞侵蚀及破坏作用，其原理是通过降低炎性因子TNF-α和IL-6的含量来减轻关节处的炎症继而降低炎症对关节的侵蚀和损坏。

Figure8 Photographs of representative left hind legs from different treatment groups (A) and histopathology in ankle joints identified using hematoxylin-eosin staining of arthritic joints in different treatment groups (B)

4 讨 论

类风湿性关节炎是一种以慢性炎症为主的自身免疫性疾病，目前的抗类风湿的治疗多以抗炎为主[27]，炎症因子是导致类风湿性关节炎病理的主要病因，TNF-α和IL-6与类风湿性关节炎的诸多病理现象密切相关，因此TNF-α和IL-6是治疗类风湿性关节炎的热门靶点。

本研究通过酸提碱沉法制备出苦木总生物碱，并对提取的苦木总生物碱进行了定性研究，解析出其中的14个化合物，定量出其中3个代表成分的含量,为苦木总生物碱的质量控制提供一定参考与借鉴。药效实验从细胞和动物两个层面证明了苦木总生物碱具有很强的抗TNF-α和抗IL-6活性；动物药效实验也从关节肿胀程度分析，关节切片分析等多个层面证明了苦木总生物碱(尤其在1.814 mg/kg的剂量下)的确能够抑制胶原诱导性关节炎的疾病进展。因此，苦木总生物碱有望成为一种治疗抗类风湿性关节炎的候选药物。后期可通过，Western blot及PCR等技术进行更深层次的药理活性研究。