凉血通瘀方对脑出血大鼠氧化应激和炎症反应的影响

顾恒，李建香，刘云芳，过伟峰

(南京中医药大学，江苏 南京 210046)

脑出血在我国约占全部卒中的20%～30%，急性期病死率和致残率高，存活患者也大多遗留后遗症。受限于各地医疗水平，现代医学认为降低脑出血负担的最佳方法仍以预防高血压为主[1]。国医大师周仲瑛教授在中风痰热腑实学说基础上，创新性地提出瘀热阻窍学说。认为本病系火热毒邪壅于血分，瘀热搏结，气火上冲，迫血上涌，灼伤脑络；同时因脑中蓄血，郁而化热，络热血瘀，进一步损害脑元。据此，创制凉血通瘀方治疗，功效凉血散瘀、通腑泻热。临床观察评价凉血通瘀方治疗脑出血的临床疗效，经168例观察，总有效率88.0%，优于对照组(169例)的77.5%(P<0.05)[2]。

脑出血后脑损伤主要在于原发性血肿引起的占位效应以及继发性病理改变。血肿周围的缺血水肿区形成后，脑组织急性氧化应激，生成的超氧阴离子自由基攻击生物细胞膜大分子，同时引起一系列的炎症反应。而中性粒细胞浸润后会产生更多的活性氧，加重氧化损伤。氧化应激和炎症反应贯穿本病各个阶段，是导致神经功能缺损的关键机制。本实验旨在从抗氧化和抗炎角度探讨凉血通瘀方发挥神经功能保护的作用。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠80只，体质量250～300 g，合格证号：SCXK(浙)2014-0001。于南京中医药大学动物实验中心饲养，5只/笼，自由饮水摄食，7:00～19:00光暗交替，恒温恒湿。

1.2 主要实验药物与试剂

凉血通瘀方：生大黄10 g,水牛角30 g,生地黄20 g,赤芍15 g,牡丹皮10 g,石菖蒲10 g。中药材按常规方法水煎煮浓缩，每毫升含生药1.2 g。

Takara SYBR Premix Ex Taq(日本Takara公司)，Takara PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)(日本Takara公司)，nNOS、TLR-4、IL-1β引物(上海生工生物工程有限公司)，MDA检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.3 主要实验仪器

脑立体定位仪(成都泰盟软件有限公司)、酶标仪(美国PerkinElmer公司)、注射泵控制器(保定兰格恒流泵有限公司)、7500 Real Time PCR仪(美国ABI公司)。

2 方法

2.1 脑出血模型的建立

大鼠称体质量编号，喂养一周后参照Xue M[3]自体尾动脉血注入法，制备大鼠脑出血模型，造模后评估神经功能缺损程度。选取Longa评分法中1～3分的大鼠作为模型动物。

2.2 动物分组及给药

大鼠随机分为以下4组，每组18只，分配至用药后1 、3 、5 d三个时间点，各时间点6只。

正常组、模型组、假手术组(开颅后插入进样器针头但不注血)：予用药组等体积生理盐水。

凉血通瘀组：造模后3 h开始灌胃用药，给药量均为1 mL/100 mg体质量，每日1次，共5 d。

2.3 行为学评分

采用Longa五级评分法[4]和平衡木测验[5]，于动物苏醒后评估神经功能缺损症状。标准见表1。

表1 脑出血大鼠行为学评分标准

2.4 硫代巴比妥酸反应法检测脑组织中MDA含量

取脑组织处理后按照MDA试剂盒说明书步骤操作，依次加样孵育进行显色反应，将96孔板置入酶标仪检测吸光值，制作标准曲线，计算脑组织MDA含量。

2.5 RT-PCR法检测脑组织nNOS、CuZnSOD、TLR-4、IL-1β mRNA的表达

取体积约5×5×5 mm3大小的组织置于平头管中，放入小钢珠，按50～100 mg组织/mL Trizol加入Trizol使用球磨仪震荡击打裂解细胞，提取总RNA，使用分光光度计检测RNA浓度及纯度。按照Takara逆转录试剂说明书配制反应体系，进行逆转录。将逆转录后的产物处理后于PCR仪内进行扩增。引物设计如下：nNOS(sense primer：AATGGTGGAGGTGCTGGAGGAG；anti-sense primer: CTGGAGAGGAGCTGATGGAGTAGTAG)；CuZnSOD(sense primer：GCCGTGTGCGTGCTGAAGG；anti-sense primer: TGTAATCTGTCCTGACACCACAACTG)；TLR-4(sense primer：GCTGCCAACATCATCCAGGAAGG；anti-sense primer: TGATGCCAGAGCGGCTACTCAG)；IL-1β(sense primer：CAGCAGCATCTCGACAAGAG；anti-sense primer: AAAGAAGGTGCTTGGGTCCT)；GAPDH(sense primer：AAGGGCTCATGACCACAGTC；anti-sense primer: GGATGCAGGGATGATGTTCT)。PCR反应程序：Stage1(预变性)：Reps：1；95℃ 30 s。Stage2(PCR反应)：Reps：40；95℃ 5 s、60℃ 34 s。以GAPDH为内参，使用2公式计算目的基因相对表达量。

2.6 统计分析

3 结果

3.1 行为学评分结果

各时间点假手术组行为学评分均为0分。造模各组均出现不同程度的神经功能缺损，与假手术组比，P均<0.01。用药3、5 d后，凉血通瘀组明显低于模型组(P<0.05，P<0.01)。各造模组评分随时间逐渐下降。见表2。

表2 各组大鼠行为学评分分)

注：与假手术组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

3.2 氧化应激指标CuZnSOD、nNOS mRNA表达和MDA含量的结果

各时间点模型组脑组织CuZnSOD mRNA表达量均明显低于假手术组(P<0.01)，凉血通瘀组明显高于模型组(P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠脑组织CuZnSOD mRNA表达量

注：与正常组相比，$$P<0.01，$P<0.05；与假手术组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01

各时间点模型组脑组织nNOS mRNA表达均明显高于假手术组(P<0.01)，凉血通瘀组明显低于模型组(P<0.01)。见表4。

表4 各组大鼠脑组织nNOS mRNA表达量

注：与正常组相比，$$P<0.01；与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比，##P<0.01

各时间点模型组脑组织MDA含量均明显高于假手术组(P<0.05，P<0.01)，凉血通瘀组明显低于模型组(P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠脑组织MDA含量

注：与正常组相比，$P<0.05，$$P<0.01；与假手术组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

3.3 炎性因子TLR-4、IL-1β mRNA表达结果

用药1、5 d，模型组脑组织TLR-4 mRNA表达量明显高于假手术组(P<0.05)，凉血通瘀组明显低于模型组(P<0.05)。

用药1 d，模型组脑组织IL-1β mRNA表达量明显高于假手术组(P<0.01)，凉血通瘀组明显低于模型组(P<0.01)。用药5 d，模型组脑组织IL-1β mRNA表达量明显高于假手术组(P<0.01)。见表6。

表6 各组大鼠脑组织TLR-4、IL-1β mRNA表达量

注：与正常组相比，$$P<0.01，$P<0.05；与假手术组比较，**P<0.01，*P<0.05；与模型组比较，##P<0.01，#P<0.05

4 讨论

超氧化物歧化酶(SOD)能够利用氧化还原金属将超氧化物转化成氧和过氧化氢，过氧化氢又被过氧化氢酶和过氧化物酶立即分解成无害的水，形成机体内天然存在的抗氧化机制[6]。脂质是氧化应激涉及最多的生物靶点，其氧化过程中会产生许多二级产物，这些产物主要是醛类如丙二醛(MDA)等，这些醛类持续存在且有高反应活性，易于产生高毒性分子，与核酸和蛋白质等生物大分子相互作用，诱导细胞凋亡[7]。神经系统调控神经型一氧化氮合酶(nNOS)的活化与去活化来调节一氧化氮(NO)的含量，从而调节脑部血流。脑出血后血肿周围会出现不同程度的脑血流量改变，缺血缺氧后引发的氧化应激反应迅速产生大量NO，过量的NO会成为神经毒性物质。同时，NO作为信号分子，能够启动全身的炎症反应，抑制nNOS活性是治疗神经系统疾病的一个重要手段。TLR-4是各级炎性信号通路的初始开关，可激活下游NF-κB信号通路释放大量炎症因子，这些炎症因子如IL-1β可直接或间接参与脑出血炎性反应[8]。IL-1β在继发性脑损伤过程中大量分泌，可进一步激活巨噬细胞和星形胶质细胞，破坏血脑屏障通透性，诱导神经细胞凋亡，从而又加重脑水肿等继发性脑损害，在恶性循环的脑损伤过程中炎性反应可级联放大[9]。路梦茹[10]等研究发现抑制细胞内TLR-4表达后，可有效阻止TLR-4及下游炎症因子IL-1β、IL-6等的信号传递和表达，从而减轻脑出血炎症损伤。本实验通过大鼠的脑出血模型来观察神经功能修复水平，并测定可反映氧化应激和炎症反应的指标，试从抗氧化和抗炎方面解释凉血通瘀方对神经功能的保护作用。

实验证明，经凉血通瘀方干预后的脑出血大鼠行为学评分明显降低，神经功能缺损情况明显改善。模型组在各时间点MDA含量和nNOS基因表达增高、CuZnSOD基因表达降低，表明脑出血后氧化应激反应活跃，超氧阴离子清除率降低，损伤血管和细胞功能。模型组造模后第1天和第5天TLR-4、IL-1β基因表达均明显升高，表明炎症反应与脑出血息息相关，脑出血后脑损伤激活TLR-4大量表达后激活下游的IL-1β大量表达，损害脑功能。凉血通瘀方对比模型组，在不同时间点明显降低MDA含量和nNOS、TLR-4、IL-1β基因表达，提高CuZnSOD基因表达，发挥了抗氧化和抗炎作用。

综上所述，凉血通瘀方能够减轻氧化应激和炎症反应，有效清除氧自由基，抑制炎症的级联放大效应，从而保护脑出血后的神经功能。本实验为名老中医的有效验方的使用提供了现代科学依据。