不同炮制品组方的独活寄生汤对大鼠佐剂性关节炎的作用及炎症因子比较研究

2019-10-28 02:27李卫先王文翰刘园园王议忆
中医药学报 2019年5期
关键词:牛膝佐剂独活

李卫先,王文翰,刘园园,王议忆

(湖南中医药高等专科学校,湖南 株洲 412012)

类风湿性关节炎,是一种以关节炎症和骨质破坏为主的自身免疫性疾病。独活寄生汤由中药独活、桑寄生、杜仲、牛膝、细辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防风、川芎、人参、甘草、当归、芍药和干地黄15味中药组成[1],近代主要用该方治疗痹证日久而致正气不足者。临床主要用于治疗慢性关节炎、风湿性和类风湿性关节炎[2-5]。现代药理学研究证实,该方具有抗炎、镇痛、免疫调节等药理作用[6-7]。方中杜仲有生杜仲、盐杜仲,牛膝有生牛膝、酒牛膝,川芎有生川芎、酒川芎,当归有生当归和酒当归,白芍有生白芍和酒白芍等炮制品。但原方并未阐明方中各药所用的具体炮制品。故本研究采用佐剂性关节炎大鼠动物模型,从免疫器官、抗炎、调节炎症因子等方面对不同炮制品组方的独活寄生汤的药效进行对比实验研究,而探讨独活寄生汤临床上用于治疗佐剂性关节炎时杜仲、牛膝、川芎、当归、白芍在独活寄生汤配方中最佳的炮制品,为其临床应用提供可靠的药效学基础。

1 材料

1.1 药物与试剂

实验所用药材独活、桑寄生、牛膝、细辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防风、川芎、当归、干地黄、杜仲、人参、白芍、甘草等均由湖南中医药高等专科学校附属一医院提供,按《中国药典》(2015一部)鉴定为合格药材。弗氏完全佐剂( Freund scomplete adjuvant,FCA)为Sigma公司产品,试剂肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6) 酶联免疫试剂盒购,购自上海科兴商贸有限公司。

1.2 动物

清洁级SD大鼠225只,雌雄各半,鼠龄6周,体质量(200±20)g,均由湖南中医药大学动物实验中心代购,许可证编号:SCXK(湘)2015-0008。

1.3 仪器

中佳KLC-2046型低速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂),恒温恒湿箱(上海一恒科学仪器有限公司),全自动酶标仪(赛默飞世尔(上海)仪器有限公司)。

2 方法

2.1 样品的分组及提取

2.1.1 样品的分组

样品中独活寄生汤皆按《方剂学》教材规定的剂量称取[1],1组:组成成分为生品组方的独活寄生汤的水煎液,具体组成为:独活9 g,桑寄生6 g,杜仲6 g,牛膝6 g,细辛6 g,秦艽6 g,茯苓6 g,肉桂6 g,防风6 g,川芎6 g,人参6 g,甘草6 g,当归6 g,白芍6 g,干地黄6 g;2组:杜仲盐炙其它药物均为生品组方的独活寄生汤;3组:牛膝、川芎、当归、白芍均酒炙,其它药物均为生品组方的独活寄生汤;4组:杜仲盐炙、牛膝、川芎、当归、白芍均酒炙,其它药物均为生品组方的独活寄生汤。以上各组各药用量同1组。

2.1.2 样品的提取

以上各组药按量称取各药后常温(25℃) 加蒸馏水2 000 mL浸泡30 min,煮沸后文火煎30 min过滤药液,药渣加1 000 mL蒸馏水再煎煮25 min,合并两次滤液,浓缩至独活寄生汤约0.5 g/mL,1.0 g/mL,2.0 g/mL,放入4℃冰箱备用。

2.2 动物造模

将225只大鼠适应性饲养一周后,随机分为对照组,模型组,阿司匹林组,独活寄生汤1、2、3、4 组的高、中、低剂量组(每组15只)15组。除对照组外,其余各组大鼠左后足常规消毒后,于左后足跖皮内注射弗氏完全佐剂0.1 mL 制备佐剂性关节炎模型,正常组注射相应体积生理盐水。第7 d加强一针,复制佐剂性关节炎模型。以造模后12 d左右大鼠对侧足跖明显肿胀,行动不便并且体质量明显下降为成功的判断标准[8]。

2.3 给药剂量及方法

不同炮制品组方的独活寄生汤1、2、3、4组的高、中、低剂量各给药组于大鼠造模前3天和造模后12 d按生药量折算[9]每日灌胃给予独活寄生汤0.85,1.7,3.4 g/kg相应药, 阳性对照组灌胃给予0.2 g/kg的阿司匹林片,对照组和模型组小鼠给予等容量生理盐水,连续给药16 d,实验期间正常饲养,自由饮水。

2.4 抗炎实验

原发性及继发性足肿胀度测定在大鼠踝关节处做标记,用大鼠足趾容积测量仪分别测量于致炎前每只大鼠左、右后肢足容积(mL),分别于致炎后12、24、36、48 及72 h测定大鼠致炎侧足容积,测量3次,以致炎前、后致炎足容积差平均值作为原发性肿胀度。分别于致炎第12、16、20、24、28 d用同样方法测定大鼠非致炎侧足容积,求出肿胀度平均值作为继发性足肿胀度,以观察佐剂性关节炎大鼠原发性和继发性病变。

2.5 免疫实验

各组胸腺指数及脾脏指数、体质量增长率测定上述2.4实验中所有大鼠于致炎后28 d,禁食不禁水12 h,称定质量后用乙醚麻醉,取胸腺及脾脏并称重,分别计算胸腺及脾脏指数。脏器指数=脏器重量(mg)/体质量(g);分别记录大鼠体质量的变化情况,计算体质量增长率。体质量增长率=(给药后体质量-造模前体质量)/造模前体质量×100%。采用t检验进行组间比较。

2.6 抗炎机制实验

2.6.1 血清TNF-α及IL-6含量测定

上述2.5实验中所有大鼠于致炎后28d,麻醉后,迅速剖腹,腹主动脉取血5 mL,静置,4℃离心10 min,分离血清于-20℃保存待测。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)法按照试剂盒操作测定血清TNF-α及IL-6含量。采用t检验进行组间比较。

2.6.2 关节液PGE2含量测定

上述2.5实验中所有大鼠于致炎后28 d,麻醉后,于左侧踝关节上0.5 cm处剪下炎性肿胀足,称重、剪碎,生理盐水5 mL浸泡2 h,取出足爪,2 500 r/min离心浸泡液10 min,取上清液0.3 mL,加入0.5 mol/L KOH甲醇溶液1.0 mL,50℃水浴20 min异构化,加甲醇2.5 mL,在278 nrn波长下进行比色,用吸光度(A)表示PGE2含量。采用t检验进行组间比较。

3 结果

3.1 不同炮制品组方的独活寄生汤对大鼠原发性病变的影响

由表1可见,与正常组相比,模型组大鼠左足明显肿胀(P<0.01),不同炮制品组方的独活寄生汤从致炎后6 h开始发挥疗效。各组灌胃给药后,1组的中、高剂量组,2组中、高剂量组,3组中、高剂量组,4组中剂量组均可不同程度减轻大鼠原发性病变,左后足肿胀程度均明显轻于模型组,与模型组比较有显著的差异(P<0.05);第4组的高剂量组、阿司匹林组减轻大鼠原发性病变的作用与模型组比较有显著的差异(P<0.01)且强于其他各组和生品组,差异有统计学意义(P<0.05)。

3.2 不同炮制品组方的独活寄生汤对大鼠继发性病变的影响

由表2可见,与正常组相比,模型组大鼠在致炎后16 d右后足出现明显肿胀,且持续到第28 d,各不同炮制品组方的独活寄生汤口服给药后,1组的中、高剂量组, 2组中、高剂量组,3组中、高剂量组,4组中剂量组均可不同程度减轻大鼠继发性病变,右后足肿胀程度均明显轻于模型组,与模型组比较有显著的差异(P<0.05);第4组的高剂量组、阿司匹林组减轻大鼠继发性病变的作用与模型组比较有显著的差异(P<0.01)且强于其他各组和生品组,差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 不同炮制品组方的独活寄生物对佐剂性关节炎大鼠原发性足跖肿胀度的影响

注:与模型组比较,**P<0.01,*P<0.05;与生品组比较,△△P<0.01,△P<0.05

表2 不同炮制品组方的独活寄生汤对佐剂性关节炎大鼠继发性足跖肿胀度的影响

注:与模型组比较,**P<0.01,*P<0.05;与生品组比较,△△P<0.01,△P<0.05

3.3 不同炮制品组方的独活寄生汤对大鼠胸腺、脾脏指数和体质量增长率的影响

由表3可见,模型组大鼠的胸腺指数明显低于正常组(P<0.05); 与对照组比较,模型组大鼠体质量明显下降(P<0.01);各组口服给药后,1组的中、高剂量组,2组中、高剂量组,3组中、高剂量组,4组中剂量组与模型组比较均可明显增加大鼠胸腺系数(P<0.05)和体质量(P<0.05)。4组高剂量组可显著增加大鼠胸腺系数和体质量,与模型组比较,有显著差异(P<0.01)且作用强于其他各组和生品组,差异有统计学意义(P<0.05)。脾脏系数数值上无统计学意义,而阿司匹林对大鼠胸腺、脾脏指数和体质量无明显影响。

表3 对佐剂性关节炎大鼠体质量增长率和脏器系数及大鼠血清IL-6、TNF-α及关节液PGE2水平的影响

注:与模型组比较,**P<0.01,*P<0.05;与生品组比较,△△P<0.01,△P<0.05

3.4 抗炎机制实验

不同炮制品组方的独活寄生汤对大鼠血清 TNF-α、IL-6及关节液PGE2水平的影响

由表3可见;模型组大鼠血清TNF-α、IL-6 及关节液PGE2水平均显著高于正常组(P<0.01); 各组口服给药后,1组的中、高剂量组,2组中、高剂量组,3组中、高剂量组,4组中剂量组与模型组相比较,均能不同程度降低 TNF-α、IL-6、PGE 2水平(P<0.05)。其中,第4组高剂量组与模型组比较能显著降低 TNF-α、IL-6、PGE 2且作用强于其他各组和生品组,差异有统计学意义(P<0.05)。

4 讨论

佐剂性关节炎分原发性反应期和继发性反应期,原发性病变表现为致炎局部的炎症反应,继发性病变一般出现于致炎后10d左右,表现为双侧足肿胀进行性加重,活动受限,本病乃风寒湿邪痹着日久,导致肝肾不足,气血两虚而成的虚实夹杂之症[10]。独活寄生汤在临床上应用广泛,为治疗痹证日久方[11]。本研究选择独活寄生汤全方生品1、部分炮制2、3、4等4个组,选择全方生品,就是为了对比原方经部分药物炮制后药效作用是否增强,为探讨炮制的必要性提供依据。

本研究结果表明,佐剂性关节炎原发性、继发性模型组大鼠精神萎靡、反应迟钝、足肿胀非常明显,各不同炮制品组方的独活寄生汤治疗组随着治疗的进行,各组大鼠佐剂性关节炎症状均有明显改善作用,至服药完毕时一般体征恢复正常,由不同炮制品组方的独活寄生汤各组均优于生品组。且由盐炙杜仲、酒炙牛膝、酒川芎、酒当归、酒白芍组方的独活寄生汤高、中剂量组能显著抑制佐剂性关节炎大鼠原、继发性足跖肿胀程度,对大鼠佐剂性关节炎有明显改善作用。胸腺和脾脏是机体质量要的免疫器官,因此动物免疫功能及炎症情况在胸腺、脾脏指数方面有一定程度的表现。

本研究发现,由盐炙杜仲、酒川芎、酒炙牛膝、酒当归、酒白芍组方的独活寄生汤的高、中剂量组能够显著促进大鼠免疫器官胸腺的发育,这对于增强大鼠机体免疫机能有积极意义。TNF-α、IL-6是佐剂性关节炎大鼠模型滑膜组织的促炎因子,会刺激滑膜组织,引起PGE2及NO大量合成和释放,从而引起炎性细胞浸润、滑膜组织异常增生导致组织损伤、关节肿胀的一种状态[12]。

实验结果显示,由酒炙牛膝和盐炙杜仲、酒川芎、酒当归、酒白芍组方的独活寄生汤的高、中剂量组可明显降低佐剂性关节炎大鼠血清TNF-α、IL-6的水平并能能显著抑制PGE2含量,且上述抗炎、提高免疫、降低炎性细胞因子的作用均优于不同炮制品组方的其他组。由此推测降低佐剂性关节炎大鼠血清炎性细胞因子(TNF-α、IL-6)的水平及关节液中PGE2含量可能是独活寄生汤治疗佐剂性关节炎的机制之一,其详细机制有待于深入研究。综合文献报道及我们的研究,证实独活寄生汤用于治疗佐剂性大鼠关节炎症时,组方中牛膝和川芎、当归、白芍等药宜用酒炙品,杜仲宜用盐炙品,这与文献中记载[13-15]的杜仲盐炙能引药入肾,增强补肝肾,强筋骨,增强免疫、扩张血管,牛膝、川芎、当归、白芍酒炙能增强活血通络、抗炎、止痛的作用是一致的。

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