“肠康方”对IBS-D大鼠肠组织中SERT、5-HT3受体的影响

樊欣钰，陆敏,任杰

(1.南京中医药大学，江苏 南京 210023； 2.南京中医药大学附属中西医结合医院，江苏 南京 210028)

肠易激综合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是胃肠功能紊乱的一种腹痛伴随着排便或者其他肠道习惯改变的综合征[1-2]。腹泻型肠易激综合征(diarrhea predominant irritable bowel syndrome, IBS-D)是其最常见的一个亚型。目前，尚未有权威机构对其发病原因及发病机制做出明确解释，也未有明确疗效的治疗药物，只知其可能与内脏的敏感性增高、脑-肠轴的功能异常、消化道微生物的紊乱、胃肠道动力学的异常、精神心理等有关。近年来，随着研究的深入，针对IBS的治疗已经从针对胃肠道自身的治疗上升为针对与其相关的神经内分泌调节系统，即罗马IV所指出的脑-肠轴调控系统，同时将精神心理等因素纳入研究范围，从局部逐渐向整体入手，中医优势更为凸显。

5-HT3受体，作为5-羟色胺(serotonin，5-HT)受体的亚型之一，是中枢神经系统和胃肠神经系统周边出现的配体门控离子通道，可同时调节兴奋性和抑制性神经传导物质的传递。5-HT参与调节消化道感觉、运动和分泌功能，在神经突触间隙与突出后膜5-HT3受体结合后迅速分离后，大部分被突触前膜的受体再次摄取回收、储存[3]。5-羟色胺转运体(serotonin transporter，SERT)是对5-HT有高度亲和力的跨膜转运蛋白，能够重新摄取细胞间隙内的5-HT，从而起到灭活5-HT的作用，影响胃肠道的运动，引起腹痛、腹泻等临床症状。

近年来，中医药在治疗IBS方面取得了良好的治疗效果，并且毒副作用低，其开发前景。本研究采用名医验方“肠康方”干预内脏高敏感IBS-D模型大鼠(番泻叶叠加束缚刺激法)，解析其中药复方的多成分多靶点的的药效物质基础，挖掘并传承名老中医验方。

1 实验材料

1.1 实验动物

成年健康清洁级Wistar大鼠(上海西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证号：SCXK(上海)2013-0016)，在江苏省中医药研究院SPF级实验动物中心喂养，许可证号：SYXK(苏)2016-0018，环境温度(23±3)℃，湿度(55±5)%，自然光照，自由进食。

1.2 实验药物

番泻叶、白芍、防风、熟地黄、菟丝子、黄连、金荞麦、蝉蜕，由江苏省中西医结合医院中药房提供。

匹维溴铵片，生产厂家：Abbott Products SAS，规格：每片50 mg，批号：H20120127。

1.3 实验试剂及仪器

水合氯醛，国药集团化学试剂有限公司；苏木精-伊红染色液，武汉Boster生物工程有限公司；10%甲醛，西陇化工股份有限公司；Anti-ACTH抗体，英国Abcam公司(ab74976)；Anti-VIP抗体，英国Abcam公司(ab22736)；Anti-Substance P抗体，英国Abcam公司(SP-DE4-21)。

石蜡切片机，德国zeiss公司Microm-340E；组织脱水机，英国shandon公司Hypercenter-xp；组织包埋机，英国shandon公司Histocentre-2；电子显微镜，Olympus公司；电子秤，上海浦春计量仪器有限公司；Image Pro Plus 图像分析系统；Logene PA9000病理图像分析系统。

2 实验方法

2.1 IBS-D模型建立

造模组造模：参考[4]造模方法，番泻叶5倍体积的开水中浸泡一夜取滤液，浓缩至浓度为0.3 g/mL，灌胃体积为10 mL/kg，1次/日，在番泻叶水灌胃1 h后用自制容器及绷带束缚大鼠的四肢，限制大鼠运动的同时产生一定的刺激，束缚大鼠使得其烦躁不安，持续2 h，持续2周。空白组正常饲养，不采取任何措施。

2.2 模型评价

大鼠一般情况：造模期间精神状态、活动、大鼠毛发、食欲、体质量和粪便等。腹壁撤退反射评分(abdominal withdrawal reflex,AWR)；结肠组织病理学检查：空白组及模型组分别随机选取雌雄各1只。

2.3 动物分组与干预方法

采用随机分组法将造模成功的大鼠分成5组，模型对照组、阳性药物组、肠康方高剂量组(H-CKF)、肠康方中剂量组(M-CKF)和肠康方低剂量组(L-CKF)，每组10只。

将“肠康方”七味中药饮片(白芍15 g，防风6 g，熟地黄5 g，菟丝子5 g，金荞麦8 g，黄连3 g，蝉蜕3 g)先加入10倍水中煎煮1.5 h，倒出煎液再加入8倍体积的水中煎煮同样时间，合并2次煎液浓缩，根据60 kg/200 g人鼠转换系数w=6.25计算等效剂量，配成0.47 g/mL、0.94 g/mL、1.88 g/mL药液，给药体积为2 mL/只。

阳性药浓度：参照文献[5]配成浓度为1.5 mg/mL的药液，给药体积为2 mL/只。

正常组及模型对照组予等体积蒸馏水。

给药频次：每日1次，固定在上午8:00～10:00点间，持续2周。

2.4 观察指标及检测方法

2.4.1 一般情况

观察各组大鼠精神状态、毛发色泽、饮食、活动和体质量变化、排便情况等。

2.4.2 AWR评分

对各组大鼠造模后及药物干预后进行AWR评分。具体操作如下[6]：操作前禁食不禁水12 h，操作时将大鼠放入玻璃容器(自制)中，限制其运动，使其只能前后运动。先将2 mL注射器连接到血压计上，向血压计中注气，分别记下10、20、40、60、80 mmHg所对应的刻度，探后将注射器连接到8F导尿管。由注射器向导尿管中注气，并达到相应的刻度，表示导尿管前端球囊内的压力为相应的压强。将导尿管(型号：8F)自肛门插入，待球囊末端伸入肛门约1 cm。待大鼠平稳安静后，向导尿管内注气，使球囊内压强分别为10、20、40、60、80 mmHg。每个压强分别持续20 s，观察大鼠在各个压强下的反应，对其进行半定量评分。每个压力下重复3次并评分，取其平均值并记录。

评分标准参照文献[7]，按照刺激大鼠时的表现评分：0分，无行为反应；1分，仅头部短暂运动，身体不动；2分，腹部肌肉收缩，但未抬离底面；3分，腹肌收缩并抬离底面；4分，骨盆抬起，身体呈弓形。

2.4.3 5-HT3受体及5-HT转运体平均光密度值

处死动物后，取全脑和近直肠端约1 cm结肠，固定在甲醛中，石蜡包埋，切片后行免疫组化染色。免疫组化染色后，显微镜下观察，每个标本随机选取5个视野，以细胞核出现棕黄色染色颗粒为阳性反应，无棕黄染色为阴性，每个视野利用拍摄器截取图像。应用Image Pro Plus 软件测定其阳性表达的光密度(optical density,OD)值进行半定量分析，取其平均值。以测定结肠组织中5-HT受体及转运体水平。棕黄染色越多，OD值越大，5-HT受体及转运体表达水平越高。

2.5 统计分析

3 实验结果

3.1 大鼠一般情况观察

空白组大鼠精神良好，毛色亮白，体型适中，活动敏捷，体质量增长率25.22%，造模及药物干预期间大便正常，造模后大便变软，或成稀状、稀水状，随着时间推移情况无明显好转。

模型组大鼠造模期间精神状态较差，毛色干枯，随着造模的继续，发现大鼠活动、饮食、饮水较正常组都略有减少且喜抱聚成团，体质量无增加；予等体积蒸馏水2周后，体质量增长率为10.19%。

阳性药及各浓度肠康方干预大鼠组，造模期间及造模后状态同模型对照组；药物干预后，各组间大鼠差异不明显，均表现出精神转好，毛发逐渐恢复光亮，饮食、活动均增多，详见图1，各组增长率分别为17.14%、25.54%、29.69%、23.38%，药物干预后，腹泻逐渐消失，大便逐渐恢复正常。

A：空白组；B：模型对照组；C：阳性药组；D：肠康方高剂量组；E：肠康方中剂量组；F：肠康方低剂量组图1 各组大鼠体质量变化情况

3.2 IBS-D大鼠造模情况

造模期间死亡3只，其中1只为束缚捆绑时死亡，分析与捆绑时姿势、力度不当相关；另2只死亡，考虑因灌胃技术或饮食减少等导致。给药期间，各组大鼠均无死亡。

在观察大鼠一般情况、排便情况的同时，结合AWR评分和结肠粘膜组织形态学观察，判断大鼠造模成功率，各组大鼠造模情况如表1所示。分别选取空白组、造模组雌雄各1只，共4只，观察其肠粘膜组织形态，空白组为正常粘膜；造模组肠黏膜见灶性淋巴细胞、小脓肿，提示炎症可能，如图2所示。

表1 各组大鼠造模情况

3.3 AWR评分结果

造模结束后，与空白组相比，造模组大鼠在10、20、40、60、80 mmHg球囊压力下的AWR的评分均显著升高，有统计学意义(P<0.01)。提示：模型组大鼠内脏呈高敏感。结果见表2。

A、B：空白组；C、D：模型对照组图2 造模后空白组和造模组肠黏膜组织

表2 造模后大鼠AWR评分

注：与空白组相比，*P<0.01

表3 大鼠AWR评分

注：与空白组相比，*P<0.01；与模型对照组相比，##P<0.05，#P<0.01

药物干预结束后，与模型对照组相比，肠康方高中低剂量组及阳性药组大鼠在各压力下的AWR评分均下降。同时在10、20、40、60 mmHg球囊压力下，各组AWR评分均具有统计学意义(P<0.05)，在80 mmHg压力下，阳性药组、肠康方高剂量组、肠康方低剂量组AWR评分低于模型对照组，但无统计学意义(P>0.05)。提示：药物干预组大鼠内脏高敏感均有所减轻。见表3。

3.4 5-HT3受体及5-HT转运体的表达

与空白组相比，模型对照组大鼠肠组织中5-HT3R棕黄染色阳性表达细胞分布相对较密集，光密度OD值升高；SERT棕黄染色阳性表达细胞分布相对较分散，光密度OD值降低。

药物干预结束后，肠康方高中低剂量组、阳性药组大鼠肠组织中5-HT3R较模型对照组光密度OD值均降低， SERT光密度OD值均升高，有统计学意义(P<0.05)，但在各浓度之间未见明显相关性；

提示：肠康方高中低剂量组、阳性药物组均能够降低IBS-D模型大鼠肠组织中5-HT3R的表达，肠康方高中低剂量组、阳性药物组均能够升高IBS-D模型大鼠肠组织中SERT的表达，见表4。

表4 各组大鼠肠组织中5-HT3受体及5-HT转运体光密度值

注：与模型对照组相比，*P<0.01，**P<0.05

显微镜下观察免疫组化染色结果，可见所有切片中均可见多少不等的5-HT3R、SERT阳性表达的细胞，阳性细胞大多为圆形或椭圆形，有棕黄色颗粒。图3显示模型对照组较空白组比棕黄染色颗粒明显增多；给药后与模型对照组相比，阳性药组、肠康方高中低剂量组阳性表达颗粒明显减少。图4显示与空白组比较，模型对照组阳性表达细胞明显减少，各给药组阳性表达细胞增多。

4 讨论

IBS的病理机制目前尚未完全明确，涉及内脏高敏感、脑-肠轴异常、消化道感染、胃肠动力异常以及精神心理等多方面。近年来，随着罗马Ⅳ的出台人们越来越关注“脑-肠轴学说”，认为IBS发病与神经免疫内分泌网络调控不平衡相关，大脑接收来自胃肠道的持续内感受输入信号，将这些信号与来自身体的其他内感受信号相互整合，向胃肠道内的各种靶细胞发送。

IBS-D治疗的目标是缓解症状和改善生活质量，目前西医治疗以对症治疗为主。中医在IBS-D的治疗方面具有较好的疗效，近年来，IBS-D已成为中医药治疗的优势病种之一。名老中医验方“肠康方”，前期在临床反馈疗效较好，已获得国家发明专利和药物临床批件，方中重用白芍养血柔肝、收敛肝气、减少肠蠕动，防风入肝疏肝气、化水湿、疏脾止泻，两药共用，木能疏土，健脾调肝，共为君药。臣用熟地、菟丝子补肾阴肾阳，补肾火温脾胃，而黄连清心降火，三药同用，则心肾交通，情志得遂。金荞麦、蝉蜕为佐药，金荞麦清肺热，肺合大肠，肺降则肠安；蝉蜕入肝经入肺经，消风解痉，减轻肠道痉挛。全方调和肝脾、交通心肾、缓痛止泻、宁神畅情。现代研究发现白芍内的主要活性成分白芍总苷可通过阻断信号通路、抑制免疫细胞等方式缓解炎症反应[8-9]，减缓疼痛[10-12]；刘振清等将大鼠结肠平滑肌分离，通过对照试验观察防风其收缩运动的影响发现防风能够抑制其平滑肌收缩[13]。熟地黄首载于《本草图经》，作用于人体可增加人体免疫力，具有抗肿瘤、促进血液再生、抑制机体衰老等效果[14]。菟丝子始载于《神农本草经》，其可以调节免疫、抗衰老保护生殖系统、调节代谢和内分泌、调节心血管、营养神经、改善记忆、抗疲劳等作用[15]。黄连其主要有效成分小檗碱、黄连碱等能够广谱抗菌，并且具有缓解炎症、清热、抗细菌毒素、治疗腹泻、抗病原体、抑制肿瘤等药理作用[16]。范万里发现，金荞麦提取物可降低其血清炎症水平[17]。蝉蜕首载于《名医别录》[18]，具有抗肿瘤和解热镇痛的效果[19]。本实验选择的阳性药为“匹维溴铵”，选择性肠平滑肌钙离子拮抗剂，能够缓解患者腹痛以及整体症状，是《中国肠易激综合征专家共识意见(2015)》推荐的临床常用药物，国际上多个指南与共识意见也将其列为一线药物[20-21]。实际应用中也有诸多报道[22-24]显示选用匹维溴铵对腹痛、腹部不适、腹泻和IBS-D其他症状有显著改善。

A：空白组； B：模型对照组； C：阳性药组； D：肠康方高剂量组；E：肠康方中剂量组； F：肠康方低剂量组图3 各组大鼠肠组织5-HT3结果(免疫组化染色，×200)

A：空白组； B：模型对照组； C：阳性药组； D：肠康方高剂量组；E：肠康方中剂量组； F：肠康方低剂量组图4 各组大鼠肠组织SERT结果(免疫组化染色，×200)

本研究运用改良后的造模方法，来构建IBS-D大鼠模型。研究观察显示“肠康方”能够明显改善IBS-D模型大鼠的腹泻症状，能够明显降低其AWR评分(P<0.05)，改善肠道高敏感。5-HT3受体是一个五聚体复合体，由不同亚基组合而成的受体亚型对5-HT的反应可能不同[25-26]，广泛分布于中枢及外周神经系统的神经细胞。5-HT通过5-HT3受体诱导肠易激综合征的内脏痛觉和超敏反应。5-HT3受体促使平滑肌收缩，并通过刺激神经末梢乙酰胆碱的释放增加肠道分泌[27]。肠易激综合征患者结肠黏膜释放5-HT与腹痛或不适的严重程度相关。此外，体外研究表明，肠易激综合征患者结肠黏膜上清可提高大鼠肠系膜感觉神经元的激活率，5-HT3受体拮抗剂格拉司琼可使刺激作用减弱[28]。本研究中模型组大鼠较空白组大鼠5-HT3受体表达明显增多(P<0.01)；匹维溴铵阳性对照组及“肠康方”高中低剂量组均可降低5-HT3受体OD值表达(P<0.05)。

药理研究[29-30]和临床研究[31-32]表明5-HT3受体拮抗剂是IBS患者的有效治疗手段，内源性5-HT失活的另一种方法依赖于内源性生物胺的SERT。Gershon的小组通过一系列研究证明了SERT的功能作用。首先，他们证明了药物5-羟色胺再摄取抑制剂抑制黏膜5-HT摄取，导致黏膜下神经元对黏膜刺激反应增强。第二，豚鼠绒毛上皮细胞失活5-HT释放肠内分泌细胞对黏膜刺激的反应。上皮细胞表达SERT导致上皮细胞重新摄取5-HT，终止其对黏膜中的作用。第三，在转基因小鼠中靶向删除编码SERT的基因会导致小鼠便秘和腹泻之间肠道习惯的改变。这种转运蛋白可以很好地调节大脑5-HT的神经传递，在大脑皮层和边缘区域有大量存在，这些区域与行为的情感方面有关。所以结合本实验研究结果显示，肠康方高中低剂量组、阳性药物组均能够升高IBS-D模型大鼠肠组织中SERT的表达(P<0.05)，从而起到缓解肠易激综合征腹痛腹泻等肠道症状。

综上所述，“肠康方”能够明显改善IBS-D模型大鼠症状，改善其肠道高敏感状态，明显减少模型大鼠结肠组织中的5-HT3受体的表达、增强SERT的表达，同时，“番泻叶灌胃+束缚刺激”的叠加复合因素造模方法可成功复制IBS-D大鼠模型，较好的模拟IBS-D的生物学特征。此外，天然药物“肠康方”相较西药匹维溴铵更具有副作用小、安全有效的优势。