早搏灵对氯化钡诱导的心律失常大鼠T型钙离子通道mRNA表达的影响

陈波,金锦玉,周亚滨,张琪,于晓红,徐京育,张雪松,宋雪,张瑜,牛雯颖

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；3.哈尔滨市穆斯林医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

心律失常可分为快速性和缓慢性两种，快速性主要以早搏、心动过速、房颤、房速、室速及室颤等居多，是心血管疾病中重要的疾病。本实验以复方中药早搏灵为实验药物，前期观察，早搏灵能够改善患者临床症状，对早搏有抑制作用，为进一步观察作用机理，以氯化钡诱导快速性心律失常大鼠，观察早搏灵对T型钙离子钙离子通道α1H亚基表达的影响。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物

选取清洁级Wistar大鼠40只，雌雄各半，体质量(227.51±6.44)g，选取的动物由哈尔滨医科大学实验动物学部提供动物合格证号SCXK(黑)2013-001。

1.2 实验药物

早搏灵胶囊由红参10 g,当归15 g,黄芪20 g,山楂15 g,麦冬15 g,青皮15 g,黄芩15 g,苦参15 g,丹参15 g,等组成，由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室制备，黑药制字Z20110063，批号：20170324；盐酸维拉帕米片,批号：161001，天津市中央药业有限公司。氯化钡(分析纯),批号：20160401，天津市光复科技发展有限公司；水合氯醛(分析纯),批号：20151215，天津市光复精细化工研究所；生理盐水,批号161104D12，哈尔滨三联药业股份有限公司。

1.3 实验仪器

十六导生理记录仪MP150(BIOPAC Systems,Inc.),荧光定量PCR仪(美国bio-rad公司),BECKMAN低温超速离心机(美国贝克曼库尔特有限公司),TGL-16G型高速台式离心机(上海医用分析仪器厂)。

1.4 实验方法

1.4.1 分组及给药方法

选用健康大鼠40只,随机分4组,维拉帕米对照组，生理盐水组,早搏灵胶囊组，模型组,每组10只，每日灌胃给药1次，连续1周。模型组、空白组予以生理盐水10 mL/kg灌服 ；中药防治组予34.6 mg/mL的早搏灵溶液10 mL/kg灌服 ；对照组予以3.32 mg/mL的维拉帕米溶液10 mL/kg灌服。末次给药1 h后，记录正常心电图，然后用5%水合氯醛(10 mg/kg)腹腔注射麻醉后,再经大鼠舌下静脉注射氯化钡(8 mg/kg)，同时描记大鼠心电图变化，包括注射后0 min，1 min,3 min,5 min,10 min,20 min，间隔10 min进行一次记录，至心电图和心率回复正常。氯化钡造模后，大鼠出现不同程度的恶性心律失常。心电观察完毕后，取心肌组织，液氮冻存后置于-80℃冰箱保存。采用荧光定量实时PCR技术观察心肌组织钙通道基因α1H的变化。

1.4.2 实时荧光PCR条件及方法

采用总RNA提取试剂盒(TIANGEN)提取组织中总mRNA，经过紫外分光光度计，检测OD260/OD280，计算RNA的浓度与纯度。用cDNA试剂盒(transgen)将5 μg的mRNA逆转录成cDNA。以2 μL的cDNA为模板，利用针对α1H设计的引物(正向5′-AAGATGAGCCCTCCCTGCAT-3′；反向5′-GTAGTGTTGCCTCCTTCGGC-3′)、Kir2.1设计的引物(正向5′-TCGATAGCGGAATCGACCGT-3′；反向5′-ATGAACTCCGGCATTGCGTT-3′)和SCN5设计的引物(正向5′-CCAGAGTGCCAGGAATCAGC-3′；反向5′-GGCCTTCATGTCCGCTATGG-3′)，PCR扩增特异性片段。PCR的反应条件如下：a:95℃ for 1 min,b:95℃ for 0:10,c:60℃ for 30 s(+Plate Read),d:Go To b 39 more times,e:Melt Curve 65 to 95℃,increment 0.5℃ for 5 s(+Plate Read)，针对GAPDH的PCR产物作为平行参照(GAPDH:正向引物5′-AGCTTCGGCACATATTTCATCTG-3′；反向引物5′-CGTTCACTCCCATGACAAACA-3′)。

1.4.3 统计学分析

2 结果

2.1 早搏灵胶囊对大鼠心律失常持续时间的影响 见表1

表1 氯化钡造模后大鼠心律失常持续时间的比较

注：与模型组比较，*P<0. 05

给予灌胃给药相应计量氯化钡后，生理盐水组没有一例发生快速性心律失常。经统计学数据分析后显示:早搏灵胶囊组、模型组与维拉帕米组经检验符合正态性。三组快速性心律失常持续时间经单因素方差分析，具有极显著性差异(P<0.01)。在此之后行LSD-t检验，其中模型组与维拉帕米组、模型组与早搏灵组与比较，心律失常持续时间均缩短，有显著差异性(P<0.01);早搏灵组与维拉帕米组比较，差异不具有统计学意义(P>0.05)，证明两者均可降低心律失常持续时间，因此不能证明两者在心律失常持续时间的影响上有差异。

2.2 各组大鼠钙离子通道α1H亚基表达结果

表2 各组大鼠钙离子通道α1H亚基表达结果

注：基因差异表达倍数>1为高表达，<1为低表达；<0.5或>2为有显著性

从表2中看出，经大鼠舌下静脉注射氯化钡，当大鼠出现快速性心律失常后，早搏灵胶囊组与模型组相比，T型钙通道α1H亚基为低表达，有显著性差异，证明早搏灵胶囊对T型钙通道α1H亚基表达有抑制作用；维拉帕米组T型钙通道α1H亚基为高表达，说明维拉帕米对T型钙通道α1H亚基表达无明显抑制作用。

3 讨论

早搏灵胶囊具有益气养阴、理气活血之功效。早搏灵胶囊方中以红参为君药，长于大补元气，又能安神生津。臣药有黄芪、当归、丹参。黄芪是补气之要药，与红参相配伍，令气旺血行，达到瘀去络通作用。麦冬具有生津养阴、清心除烦之功,与红参相伍益气养阴复脉是生脉,散主药。当归补血养血又活血,山楂行气散结。丹参祛瘀止痛，又有安神养心定志作用。青皮为佐药行气活血。黄芩、苦参清热防药物过于滋腻。现有药理学研究发现，早搏灵胶囊中黄芪、当归等可以作用于钙离子通道，调节细胞内Ca2+浓度，心肌细胞膜上的Ca2+内流减少，细胞内Ca2+超载的现象降低，心肌细胞膜结构得到稳定，保护心肌，从而心肌组织传导性得到改善，可以对抗各种原因引起的快速性心律失常[1-2]。

氯化钡造模，诱发大鼠出现快速心律失常，具有多样性和复杂性的特点，其作用原理是氯化钡可以抑制钠-钾泵，导致细胞内钠高钾低，同时因钠-钙交换，使细胞内钙超载，钙过量的结果可诱发快速性心律失常[3]。现代研究表明，通过调控钙离子通道，可有效治疗快速性心率失常[4]。钙离子进入细胞内，主要有两种方式，分别是化学门控式和电压门控式。在血管平滑肌中主要的电压门控式钙通道分为L型和T型两种电压门控式钙通道。T型钙通道可参与心脏的起搏活动，如果T型钙通道被完全阻断心脏起搏活动就可以减慢20%。研究发现，心房起搏细胞上的T型钙流比非起搏细胞要大,当阻断T型钙流，可以减慢心率，达到控制快速心律失常作用[5]。近年来的研究多支持 T 型钙通道功能的异常与心血管疾病有密切联系。T型钙通道具有快激活、快失活、慢去活、单通道电容小，以及低电压激活(-60 mV)的特性，因此被称为低电压激活钙离子通道。T型钙离子通道在心脏心肌传导组织、动脉血管壁上、以及神经激素释放的部位中含量较高, 因此在兴奋传导电流时生理病理意义非常重要[6]。在脊椎动物中，T 型钙离子通道包括3个不同的α1亚基基因: CACNA1G、CACNA1H、CACAN1I，分别编码 α1G、α1H、和α1I[7]。每个α1亚单位在膜电位发生变化时可以控制通道的开放和关闭[8]。在某些病理状态下的心脏疾病中，T型钙通道可以阻断钙离子由细胞外向细胞内的过多内流，而参与细胞内钙离子的调控，从而减少细胞内钙离子过多的现象，减少心律失常的发生[9]。近两年有研究，同样发现心律失常的原因可能与心室肌T型钙通道表达增多有关[10]。T型钙通道在心肌症状发展过程中可能对心肌细胞的重塑起重要作用[11]。

本实验研究结果表明，比较心肌组织T型钙通道α1H亚基表达水平，早搏灵组T型钙通道α1H亚基与模型组比较显著低表达。早搏灵组与维拉帕米组相比较，早搏灵组心肌组织T型钙通道α1H亚基表达水平下调，而维拉帕米组与模型组无差异性，说明在T型钙离子通道α1H亚基拮抗作用方面，早搏灵胶囊优于维拉帕米。早搏灵作用机制可能是下调T型钙离子通道α1H亚基表达，减少病理状态下心肌组织内Ca2+过多内流，从而减少细胞内钙离子超载状态。这可能是其治疗快速性心律失常的机制之一[12]。

4 结语

当今，心血管疾病已严重危害人们身体健康，特别高发于中老年人群，具有患病率高、致残率高和死亡率高的特点，快速心律失常持续发作如果治疗不及时，最终结果可导致病人猝死。在今后的研究实验中应该更深入、更全面地掌握中药抗心律失常的作用机制，在临床实践中进行更大样本、更细致的研究，使中医药在治疗快速型心律失常方面的水平得到进一步提高。