外周血成纤维细胞激活蛋白表达水平在冠心病诊断中的作用及临床意义

陈 涛 孟祥平 余 明 张 欢 范稣圳 蒋学俊 徐 林

冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease，CAD)是一类以动脉粥样硬化为基础的慢性炎性疾病，依据血管内斑块情况及患者临床表现等可以分为稳定性冠心病(stable coronary artery disease, SCAD)、急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)两大类。近年来，ACS的发生率明显增高，ACS及其远期并发症(如心力衰竭、恶性心律失常等)已成为发达国家人群死亡的主要原因。临床实践中，早期血运重建是公认治疗ACS的有效手段，但在冠状动脉斑块破裂导致狭窄甚至闭塞过程中，心肌缺血持续存在的，心肌损伤是不断进展的，而严重缺血造成的心肌损伤不可逆转[1]。因此，ACS的快速诊断方法、ACS确诊后如何判断心肌损伤程度及ACS患者预后评估仍是临床研究的重点。

成纤维细胞激活蛋白(fibroblast activation protein，FAP)是一种具有二肽酶和Ⅰ型胶原酶活性的跨膜蛋白，最早因其大量表达于成纤维细胞膜表面而得名。除明胶和Ⅰ型胶原纤维外，其底物还包括α2-抗纤溶酶、B型利钠肽、Y型神经肽、P物质等多种神经肽[2～4]。研究表明，FAP的升高与胚胎形成、癌症、特发性肺纤维化、肝硬化、愈合伤口和关节炎中间充质组织的活性重塑有关[5]。国外研究也发现在心肌梗死后活化的心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)及动脉粥样硬化斑块中均有FAP的表达，在外周血中以非膜上的可溶性FAP(soluble FAP，sFAP)形式循环[2，6～8]。因此，本研究旨在研究外周血FAP(circulating FAP，cFAP)在不同类型冠心病患者中的表达情况及其相关性，并进一步探讨cFAP作为ACS快速诊断、心肌损伤程度判断及疾病预后评估指标的可行性，现报道如下。

资料与方法

1.研究对象:经武汉大学人民医院医学伦理学委员会审核批准，所有受试者均签署知情同意书。选取2018年6～12月在武汉大学人民医院心内科住院并确诊的 CAD 患者109例，其中SCAD组22例，ACS组87例，包括不稳定型心绞痛(UA)26例，非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)16例，ST段抬高型心肌梗死(STEMI)45例。另选取同时期就诊于笔者医院的排除冠心病诊断的体检者26例作为对照组。受试者的分类依据为WHO诊断标准和我国冠心病分类标准，所有受试者均排除伴有感染性疾病、自身免疫系统疾病(活动期)、肝肾功能不全、恶性肿瘤、慢性阻塞性肺疾病、甲状腺疾病等。同时收集患者一般临床资料，包括性别、年龄、心率、吸烟史、饮酒史、糖尿病病史、高血压病史、高脂血症病史等。

2.研究方法：(1)标本采集：所有受试者于入院当天采集静脉血5ml置于EDTA-K2抗凝管中，采集4ml置于无抗凝剂的红头管中，所有血标本3000r/min离心10min，分离上清液并置于-20 ℃冰箱保存待测。(2)实验室检测指标:采用全自动血液分析仪(日本Sysmex公司，型号：XE-2100)检测白细胞计数(WBC)、中性粒细胞比率(NEU%)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)；采用西门子ADIVA2400全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(Tch)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平；采用西门子ADVIA Centaur XP全自动免疫分析检测超敏肌钙蛋白(ultra-TnI)。(3)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)检测cFAP：检测标本中的cFAP表达水平前将冻存标本在室温下放置2h，后应用ELISA法进行检测，试剂盒购自武汉大风生物科技有限公司(编号：ab193701)，并严格按照试剂盒说明书进行操作。

3.统计学方法：采用SPSS 21.0统计学软件对数据进行统计分析，符合正态分布的资料两组间比较用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析；不符合正态分布的资料进行非参数U检验。利用受试者工作曲线(ROC)，对cFAP表达水平对不同类型冠心病的诊断进行特异性和敏感度分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.3组患者一般临床资料比较:3组患者的一般情况(性别、年龄、心率)比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，ACS组吸烟史阳性率、饮酒史阳性率、高血压病史阳性率均高于对照组(P<0.05)；与SCAD组比较，ACS组吸烟史阳性率更高(P<0.01)。3组患者糖尿病阳性率、高脂血症发生率比较，差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1 3组患者一般临床资料比较

2.3组患者实验室检测指标、cFAP表达水平比较:ACS组与对照组比较，白细胞计数、中性粒细胞比率、hs-CRP、ultra-TnI升高，差异有统计学意义(P<0.05);与SCAD组比较，白细胞计数、ultra-TnI升高，差异有统计学意义(P<0.05)。3组患者间各项血脂水平(包括Tch、TG、HDL-C、LDL-C)比较，差异无统计学意义(P>0.05)。ACS组的cFAP表达水平(69.28±21.33ng/ml)显著低于对照组(108.31±26.56ng/ml)及SCAD组(99.63±24.43ng/ml)，差异均有统计学意义(P<0.05),对照组与SCAD组比较，差异无统计学意义(P>0.05,表2)。

表2 3组患者实验室检测指标、cFAP比较

3.cFAP在CAD患者中的诊断价值:应用ROC曲线模型分析，显示cFAP的AUC为0.85(95%CI:0.78～0.92，P<0.05), 敏感度为79.2%，特异性为78.4%,提示cFAP表达水平的测定在排除ACS诊断中有一定的临床价值(图1)。

讨 论

CAD是一种以动脉粥样硬化为病理基础的典型慢性炎性疾病，其中冠状动脉内膜损伤是其始发因素，继而由于机体血脂代谢紊乱，损伤处发生脂质沉积，血管平滑肌细胞(smooth muscle cell，SMC)异常移行、增殖并形成纤维帽，此过程中伴有大量淋巴细胞、单核-吞噬细胞等炎性细胞浸润[9]。CAD是心血管系统的高发疾病之一，随着人群生活习惯的改变，其亚型之一的ACS发生率逐年增高，且愈显年轻化，即便在各类冠脉血运重建技术日益发展的今天，ACS患者的死亡风险也依旧居高不下，因此ACS的早期识别十分重要。

FAP最早被发现为一种细胞表面糖蛋白，含有由丝氨酸蛋白酶的催化结构域、跨膜结构域和短细胞质尾组成的细胞外结构域，与二肽酶4 (DPPIV)属于同科酶蛋白，除了二肽酶活性，还具有Ⅰ型胶原酶活性，能够降解基质金属蛋白酶(matrix metalloproteases, MMPs)预裂解后的Ⅰ型胶原纤维，而Ⅰ型胶原纤维是各类组织细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的主要成分[10]。

既往研究表明，FAP富含于胚胎时期的间充质组织，成年后其表达水平逐渐下降，但当机体发生慢性炎症、纤维化、伤口愈合等组织损伤、修复过程时，会导致相应组织的ECM重构，组织中成纤维细胞(fibroblast，Fb)活化，FAP表达升高，表明FAP与各类组织的纤维化存在相关性，这一观点在肿瘤相关纤维化、肝纤维化及肺脏相关纤维化等相关研究中均已得到证实，FAP可作为一种纤维化标志物用于评估相关疾病的纤维化程度[11～13]。而FAP本身具有降解胶原纤维的作用，这一点正是目前逆转纤维化研究应用的关键原理。Egger等[14]利用FAP抑制剂PT100治疗小鼠肺纤维化模型，确证其抗纤维化作用。心肌梗死(myocardial infarction，MI)后，cFs大量增殖并向肌成纤维细胞转分化，沉积大量ECM蛋白以维持梗死心室的结构完整性。Nagaraju等[15]在猪心肌梗死模型中发现,梗死区近端较远端比较，间质和血管周围纤维化明显、Ⅰ型胶原纤维沉积。其中涉及转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)通过经典的SMAD2/3信号调节cFs的增殖，且在梗死的心肌中,CFs可能会对活性氧和白细胞介素-1的刺激产生反应，获得一种促炎的表型，作为趋化因子和细胞因子的重要来源，更促进CFs的增殖，CFs的增殖激活可致FAP表达增加[15,16]。

在动脉粥样硬化斑块中，Ⅰ型胶原约占ECM 的70%，已知在晚期冠状动脉粥样硬化斑块中，纤维帽的变薄、破裂是ACS启动的关键，其中涉及的主要机制为血管的平滑肌细胞(SMC)的丢失与纤维帽中Ⅰ型胶原纤维的降解[17]。Brokopp等[7]发现FAP介导的胶原降解是由炎性信号诱导的，在冠状动脉粥样硬化斑块中，FAP表达显著增加并与MMPs协同作用降解粥样硬化斑块中的Ⅰ型胶原纤维，使得薄纤维帽型动脉粥样硬化斑块中的Ⅰ型胶原纤维降解后斑块稳定性大大下降，更易破裂。在小鼠动脉粥样硬化模型中，二肽基肽酶-Ⅳ(dipeptidyl peptidase，DPPⅣ)抑制剂的使用可以减伤斑块面积，增加胶原纤维的合成，使斑块趋于稳定，提示属于同科酶蛋白的FAP同样具备这方面的作用[18]。

本研究结果显示，ACS组cFAP表达水平明显低于SCAD组及对照组，这有别于既往研究中动脉粥样硬化斑块、MI后心肌缺血部位的组织中FAP的高表达。解释血清中检测到cFAP的原因可能是由损伤部位的心肌组织释放的，此过程涉及相应区域的心肌细胞一定时间的缺血、缺氧后坏死致胞质内物质释放[4]。本实验中用于检测的血液标本是患者入院当天采集的，此时可能仅有部分心肌细胞死亡、裂解，而大部分心肌细胞仍仅处于缺血阶段。ACS患者cFAP浓度低可能反映的是在ACS事件发生前，ACS患者的cFAP水平处于一种低浓度稳定状态，可能是由于此时各类细胞向外分泌的FAP减少。cFAP随血液循环可能流经、聚集于局部损伤组织，参与组织损伤后的修复，促进胶原蛋白降解；且心肌损伤后，为挽救损伤心肌，创伤愈合反应中释放的各类酶可能会降解cFAP，使得cFAP水平下降。据此，笔者猜想在ACS发生更长的时间后，cFAP的水平可能逐日增加至受损心肌完全修复。本研究还发现，cFAP表达水平与 WBC计数、NEU%、hs-CRP以及ultra-cTnI呈负相关，而WBC、NEU%、hs-CRP以及ultra-cTnI作为临床上常用的炎性反应及心肌损伤的指标，可能提示cFAP与此有关，一定程度上可以用于评估患者的预后。

综上所述，FAP可以作为炎性疾病及纤维化相关疾病的诊断标志物，也用于心脏纤维化程度及动脉粥样硬化斑块稳定性的评估指标。在外周血中检测cFAP的难度远低于检测相应脏器组织中FAP的表达，大大提升了FAP检测在临床中应用、推广的可行性。对ACS患者来说，cFAP的检测可用于CAD患者中ACS的排除诊断，联合WBC、NEU%、hs-CRP以及ultra-cTnI等指标，可以在一定程度上反映炎性反应强弱及心肌损伤程度，从而实现对患者疾病预后的判断。当然，FAP与ACS更深的发生、发展机制及FAP与其他类型心血管疾病的关系还有待于进一步研究。