高产胞外多糖沙棘根瘤内生细菌的筛选、鉴定及其发酵条件优化

(西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州 730070)

多糖是自然界中含量最丰富的天然大分子化合物,广泛存在于动、植物组织以及藻类和微生物发酵液中[1],根据其来源不同可分为动物多糖、植物多糖、真菌多糖、藻类多糖和细菌多糖[2]。相较于其他种类多糖而言,细菌多糖具有生产周期短,不受季节、地域、病虫害条件限制等优点。细菌多糖根据其存在形式,可分为三种:以脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)O抗原的形式吸附在细胞膜表面,以荚膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)的形式粘附在细胞周围,或是以胞外多糖(Exopolysaccharide,EPS)的形式分泌至周围环境中[3]。相比胞内合成多糖的方式,分泌到细胞外的多糖在获取时,更易与菌体分离,避免破坏细胞的生理结构及其活性,使多糖的获取更具延续性,并能通过深层发酵实现工业化生产。目前,已大量投产的细菌多糖主要有黄原胶、结冷胶、普鲁兰多糖等[4],可作为凝固剂、乳化剂等被广泛应用于食品、化工、制药等多种领域,具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景[5]。

据统计[6],现已发现49属76种微生物产胞外多糖,其中产胞外多糖的细菌主要有根瘤菌(Rhizobium)、芽孢杆菌(Bacillus)、链球菌(Streptococcus)、乳杆菌(Lactobacillus)等,但关于植物内生菌产胞外多糖的研究甚少[7]。植物内生菌(Endophyte)作为一种新型的微生物资源,在利用宿主植物提供的营养物质与生存空间的同时,通过分泌生物活性物质,对寄主植物产生多种生物学作用,具有重大研究意义和应用价值[8]。沙棘是胡颓子科沙棘属的落叶灌木或亚乔木,根系发达,被弗兰克氏菌侵染根部后共生形成根瘤。除弗兰克氏菌外,沙棘根瘤中还含有其他种类内生细菌[9],能够向胞外分泌次级代谢产物。

本文对实验室分离到的沙棘根瘤中的6株能够产生胞外多糖的内生细菌进行研究,筛选出高产胞外多糖的菌株,对其进行鉴定,并对高产胞外多糖菌株的发酵条件进行优化,确定该菌株的最佳产糖条件,以期为产胞外多糖的沙棘根瘤内生细菌的工业化生产提供参考,并为后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

6株分离自沙棘根瘤中的内生细菌 由本实验室筛选并保藏;PCR引物 为通用引物,由北京诺禾致源生物信息科技有限公司合成;透析袋(MD44,截留分子量7000) 上海泰坦科技股份有限公司;葡萄糖、蔗糖、硝酸钾、磷酸二氢钾、氯化钠、蛋白胨等试剂 均为国产分析纯。

H1850R型台式高速冷冻离心机 长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司;V-5000型可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;PHS-3C型酸度计 上海仪电科学仪器股份有限公司;12ND型真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司;RE-3000型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;HZQ-F160A型恒温振荡器 上海一恒科学仪器有限公司;MyCycleTM Thermal Cycle PCR仪 德国Biometra公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配制 牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、琼脂18 g/L,pH7.0～7.2,121 ℃灭菌20 min。

QMOD培养基:葡萄糖10 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母浸膏0.5 g/L、K2HPO40.3 g/L、NaH2PO40.2 g/L、KCl 0.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCO30.1 g/L、柠檬酸铁1 mL/L、卵磷脂1 mL/L、玉米素100 μL/L、JA微量元素原液1 mL/L、琼脂18 g/L,pH6.8～7.0,115 ℃灭菌20 min。

TB培养基:胰蛋白胨12 g/L、酵母提取物24 g/L、甘油4 mL/L、K2HPO412.54 g/L、KH2PO42.31 g/L、琼脂18 g/L,pH7.0～7.2,121 ℃灭菌20 min。

LB液体培养基:蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、酵母提取物5 g/L,pH7.0～7.2,121 ℃灭菌20 min。

LB固体培养基:蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、酵母提取物5 g/L,琼脂18 g/L,pH7.0～7.2,121 ℃灭菌20 min。

基础培养基[10]:葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、琼脂18 g/L,pH7.0～7.2,115 ℃灭菌20 min。

种子培养基:LB液体培养基。

基础发酵培养基[10]:液体基础培养基。

1.2.2 菌株的活化 利用接种环挑取斜面保存的6株产糖内生细菌,分别接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行活化,在30 ℃、220 r/min条件下振荡培养12 h[11]。

1.2.3 菌株胞外多糖的提取 参考王爽[12]胞外多糖制备与测定的方法,略作改动。将已活化的菌株接种至LB种子培养基,180 r/min摇瓶培养24 h后,以10%的接种量转入基础发酵培养基中,180 r/min 30 ℃条件下发酵培养48 h后,将菌株发酵液4000 r/min离心15 min,取上清液10 mL,加入4倍体积95%乙醇,4 ℃下醇沉过夜,离心收集沉淀,将沉淀加适量水复溶,得到菌株胞外多糖水溶液,备用。

1.2.4 菌株胞外多糖产量的测定 利用苯酚-硫酸法[13]测定菌株胞外多糖水溶液中总糖的产量,利用DNS法[14]测定菌株胞外多糖水溶液中还原糖的产量,以空白培养基为对照,分别制作葡萄糖标准曲线,重复三次,将结果代入标准曲线方程,计算菌株胞外多糖的产量。

1.2.5 菌株胞外多糖产量的计算 菌株胞外多糖的产量(mg/mL)=菌株胞外多糖中总糖的产量(mg/mL)-菌株胞外多糖中还原糖的产量(mg/mL)。

1.2.6 高产胞外多糖菌株的筛选 参考1.2.3～1.2.5中的方法,将6株产胞外多糖内生细菌接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行发酵,根据6株内生细菌的EPS产量筛选高产菌株。

1.2.7 菌株的鉴定

1.2.7.1 形态学鉴定 参考《常见细菌系统鉴定手册》[15],分别依据菌株的菌落形态特征和显微形态特征进行鉴定。

1.2.7.2 生理生化鉴定 对菌株进行淀粉水解、脂酶、明胶液化等生理生化指标检测,参考《常见细菌系统鉴定手册》[15]进行生理生化鉴定。

1.2.7.3 16S rRNA序列分析及系统发育树的构建 菌株的DNA提取采用微波法[16],将振荡培养好的菌悬液于10000 r/min离心2 min,用PBS洗涤菌体2～3次后,再次于10000 r/min离心2 min,弃上清。加入500 μL TE缓冲液进行吹打后,吸取100 μL于200 μL PCR管中10000 r/min离心2 min,弃上清。再次加入100 μL TE缓冲液进行吹打。将PCR管放入微波炉中加热40～150 s,于5000 r/min离心1 min后收集上清,即为菌株的DNA。以目的菌株DNA为模板,选取通用引物:27F(5′-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTAC CTTGTTACGACTT-3′)进行16S rRNA的PCR扩增。

PCR反应总体系[17]为25 μL:上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,模板DNA(约50.0 mg/mL)4 μL,DNA聚合酶(5 U/μL)10 μL,2x Es Taq MasterMix(Dye)15 μL,加ddH2O至25 μL。PCR扩增反应条件为95 ℃预变性5 min,95 ℃变性1 min,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,30个循环,最后72 ℃延伸10 min。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后,送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行双向测序。将测序结果提交至NCBI中GenBank数据库,使用BLAST程序查找与目的菌株有最大同源性的核苷酸序列并下载,使用MEGA 7.0生物学软件对序列进行分析比对,以邻接法构建系统发育树。结合形态学观察及生理生化试验结果,最终确定高产胞外多糖菌株的种属关系。

1.2.8 最优发酵培养基的筛选 参考1.2.3～1.2.5中的方法,将高产菌株分别接种至TB液体培养基、LB液体培养基、QMOD液体培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基及基础发酵培养基中,在培养温度30 ℃、初始pH7.0、接种量10%、装瓶量100 mL/250 mL和摇床转速180 r/min条件下,培养48 h。分别测定不同发酵液中EPS的产量,根据高产菌株在不同发酵培养基中EPS的产量,筛选出高产菌株的最适发酵培养基,作为后续实验的基础发酵培养基。

1.2.9 菌株的生长曲线及产糖曲线的测定 将高产菌株接种至最优基础发酵培养基中进行发酵。每隔2 h取一次发酵液,在600 nm处测其吸光值。在相同发酵条件下,以不接菌的基础发酵培养基作为空白对照,重复三次,绘制菌株的生长曲线。

参照1.2.3～1.2.5中的方法,每隔2 h取一次发酵液,测定高产菌株在不同培养时间下发酵液中EPS的产量,绘制菌株的产糖曲线。根据菌株产糖曲线,将EPS产量达到最大值所对应的培养时间确定为最适培养时间。

1.2.10 发酵条件的优化 将高产菌株接种至最优基础发酵培养基中,采用单因素法,依次探究发酵温度、初始pH、接种量、装瓶量以及摇床转速对高产菌株EPS产量的影响。各因素具体实验设置如下。

发酵温度:设置发酵温度分别为28、30、32、34和36 ℃,根据菌株EPS的产量确定最适发酵温度。

初始pH:设置初始pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0,根据菌株EPS的产量确定最适初始pH。

接种量:设置接种量分别为2%、4%、6%、8%和10%,根据菌株EPS的产量确定最适接种量。

装瓶量:设置装瓶量分别为40、50、60、70、80、90和100 mL/250 mL,根据菌株EPS的产量确定最适装瓶量。

摇床转速:设置摇床转速分别为120、140、160、180、200和220 r/min,根据菌株EPS的产量确定最适摇床转速。

1.2.11 发酵培养基组分的优化 采用单因素实验法,以基础发酵培养基为配方,依次探究不同碳源、氮源、无机盐的种类及其添加量对高产菌株EPS产量的影响。各因素具体实验设置如下。

碳源种类:分别用20 g/L乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、甘露醇和可溶性淀粉替换基础发酵培养基中的葡萄糖,在基础发酵条件下测定菌株EPS产量,确定最适碳源。

碳源添加量:以确定的最适碳源为发酵培养基中的碳源,设置其添加量分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55和60 g/L,在基础发酵条件下测定菌株EPS产量,确定最适碳源添加量。

氮源种类:分别用10 g/L酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、NaNO3、KNO3、NH4Cl、NH4NO3和尿素替换基础发酵培养基中的胰蛋白胨,在基础发酵条件下测定菌株EPS产量,确定最适氮源。

氮源添加量:以确定的最适氮源为发酵培养基中的氮源,设置其添加量分别为2、4、6、8、10和12 g/L,在基础发酵条件下测定菌株EPS产量,确定最适氮源添加量。

无机盐种类:分别用10 g/L KH2PO4、K2HPO4、CaCl2、MgSO4·7H2O和FeSO4·7H2O替换基础发酵培养基中的NaCl,在基础发酵条件下测定菌株EPS产量,确定最适无机盐。

无机盐添加量:以确定的最适无机盐为发酵培养基中的无机盐,设置其添加量分别为2、4、6、8和10 g/L,在基础发酵条件下测定菌株EPS产量,确定最适无机盐添加量。

1.2.12 正交实验设计 结合单因素实验结果,在最佳发酵条件下,将优化后的碳源、氮源和无机盐设置为三个因素,并以其最适添加量为参考各设置3个水平,设计L9(34)的正交实验,设计如表1所示。

表1 L9(34)正交实验因素水平Table 1 The factors and levels of L9(34)orthogonal test

1.3 数据处理

所有实验重复三次,利用Origin 7.5和SPSS 12.0对实验数据进行统计并分析。实验数据以平均值±标准差的形式进行表示,组间差异用Duncan检验。

2 结果与分析

2.1 高产胞外多糖菌株的筛选

2.1.1 葡萄糖标准曲线的测定 基于苯酚-硫酸法测定的葡萄糖标准曲线如图1A所示,标准曲线的R2为0.99863,可用于计算菌株胞外多糖中总糖的产量。基于DNS法测定的葡萄糖标准曲线如图1B所示,标准曲线的R2为0.99124,可用于计算菌株胞外多糖中还原糖的产量。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose concentration注:A:苯酚-硫酸法;B:DNS法。

2.1.2 高产菌株的筛选 将6株产胞外多糖的内生细菌进行液体发酵后,去除发酵液中菌体,分离、提取并测定EPS产量,结果如表2所示,菌株TT207与菌株TT301的EPS产量高于其余4株菌,因此选择TT207与TT301进行下一步实验。

表2 高产胞外多糖菌株的筛选结果Table 2 Screening results of the strain with

注:同列数据不同小写字母表示差异显著(P<0.05);表4,图6,图7同。

将菌株TT207与TT301接种至不同的培养基上,生长情况如图2所示,菌株TT301出现菌种退化的现象,活菌数量减少,该现象的出现可能是由于培养基提供的营养条件与内生菌在宿主植物体内的营养状况存在差异,不足以维持菌株的原始生境而影响其生长。与菌株TT207相比,菌株TT301生长缓慢,不利于后续研究,因此选择菌株TT207作为高产菌株进行后续实验。

图2 菌株TT207与TT301在不同培养基上的菌落形态Fig.2 Colony morphology of strain TT207 and TT301 on different culture medium注:A:菌株TT207在基础培养基上的菌落形态;B:菌株TT301在基础培养基上的菌落形态;C:菌株TT207在LB培养基上的菌落形态;D:菌株TT301在LB培养基上的菌落形态。

2.2 高产胞外多糖菌株的鉴定

2.2.1 菌株TT207的形态学特征 将菌株TT207接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上,于37 ℃培养48 h后,菌落形态如图3A所示,培养基上聚集堆积出单个菌落,菌落直径约为1 cm,中心透明,边缘为乳白色,表面湿润光滑,略有突起,边缘呈锯齿状,挑起时有较强黏性。待发育完全后,菌落大致分为三层,最外层呈乳白色粘液状,中间一层为营养体呈透明突起状,最内层向下塌陷。

菌株TT207显微形态如图3B所示,菌株TT207为革兰氏阳性菌,细胞呈杆状,并具有芽孢结构。

图3 菌株TT207的形态学特征Fig.3 Morphological features of strain TT207注:A:菌落形态;B:100×油镜下的显微形态。

2.2.2 菌株TT207的生理生化特征 菌株TT207部分生理生化特征如表3所示,该菌株不利用葡萄糖发酵产气,吲哚、V-P、甲基红、脂酶、尿素水解反应均呈阴性反应;菌株可利用葡萄糖发酵产酸,具有运动性和固氮能力,接触酶、淀粉水解、明胶液化、纤维素水解、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用、硫化氢反应均呈阳性反应。

表3 菌株TT207部分生理生化试验结果Table 3 Some physiological and biochemical test results of strain TT207

注:+:阳性反应;-:阴性反应。

2.2.3 菌株TT207的分子生物学鉴定 对菌株TT207进行16S rRNA基因序列分析,测得其基因序列长度为1445 bp。将序列提交到至NCBI中GenBank数据库进行BLAST比对,获取与其同源性高的菌株基因序列。利用MEGA 7.0软件进行序列分析,通过邻接法构建系统发育树,结果见图4。

图4 菌株TT207基于16S rRNA 序列构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of the strain TT207 based on 16S rRNA sequences注:括号中为参与比对序列的GenBank登录号,分支处标注为自展值,标尺所示长度为0.01核苷酸置换率。

如图4所示,菌株TT207与Bacillussubtilis(NR027552.1)在同一分支,说明它们的同源性高、序列相似、差异小、亲缘关系相近。结合形态学和生理生化特征将菌株TT207鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

2.3 最优发酵培养基的筛选

将菌株TT207分别接种于5种不同的发酵培养基中,均能产多糖,EPS产量结果见表4,但在基础培养基中的EPS产量较高,因此选择基础培养基作为后续实验中的发酵培养基进行产EPS的研究。

表4 最优培养基的筛选Table 4 Screening results of the

2.4 菌株TT207的生长曲线及胞外多糖产量曲线

经测定,发现菌株TT207在36 h左右进入稳定期,如图5所示,此时菌株生长速度减缓,EPS大量积累,菌株TT207的EPS产量在48 h处达到最大值。因此,将48 h作为菌株TT207产胞外多糖的最佳发酵时间。

图5 菌株TT207的生长曲线及胞外多糖产量曲线Fig.5 The growth and EPS production curve of strain TT207

2.5 发酵条件的优化

2.5.1 温度对EPS产量的影响 温度主要通过影响细胞膜的流动性和生物大分子的活性,进而影响微生物生命活动[22]。如图6A所示,菌株TT207的EPS产量随着温度的升高而增加,当温度达到34 ℃时,EPS产量达到最大值;随后,继续增加温度,EPS产量呈现降低的趋势,但差异不显著。因此,选择34 ℃作为菌株TT207产胞外多糖的最适发酵温度。

2.5.2 初始pH对EPS产量的影响 pH影响微生物对营养物质吸收的同时,还会影响菌体的生长及其代谢产物的合成,因此通过调节发酵液初始pH以降低对菌体的不利影响[22]。如图6B所示,当初始pH在6.0～6.5之间,EPS产量明显增加,初始pH>6.5之后,EPS产量逐渐减少,因此,选择菌株TT207产EPS的最适初始发酵液pH6.5。

2.5.3 接种量对EPS产量的影响 接种量直接影响发酵液中的最初活菌数、菌体发酵周期及其代谢水平,从而影响菌体的生长以及EPS的合成[23]。如图6C所示,菌株TT207的接种量在2%～4%之间,其EPS产量随接种量的增大而增加;接种量在4%～10%之间,EPS产量随接种量的增大而减少;当接种量为4%时,EPS产量达到最大值。因此,选择4%作为菌株TT207的最适接种量。

2.5.4 装瓶量对EPS产量的影响 装瓶量影响发酵过程中菌株的通气状况,适宜的溶氧状况是影响菌体生长及其合成代谢产物的关键。如图6D所示,菌株TT207在装瓶量为70 mL/250 mL时,EPS产量达到最大值,因此,选择70 mL/250 mL作为菌株TT207的最适装瓶量。

2.5.5 摇床转速对EPS产量的影响 摇床转速会影响供氧量,从而影响菌体的代谢能力及其EPS产量。降低摇床转速会导致发酵液中溶氧量降低,使EPS产量减少;反之,升高摇床转速使发酵液中溶氧量增加,菌体生长与代谢速率升高,促进EPS产量的增加。若摇床转速过高,会引发菌体机械性损伤,导致菌体自溶,从而抑制EPS合成[24]。如图6E所示,摇床转速在120～140 r/min之间,菌株TT207的EPS产量随着摇床转速的增大而增加。当摇床转速为140 r/min时,EPS产量达到最大值。继续增大摇床转速,EPS产量随摇床转速的增大而减少。因此,选择140 r/min作为菌株TT207的最适摇床转速。

图6 发酵条件对EPS产量的影响Fig.6 Effect of fermentation condition on EPS production注:A:温度;B:初始pH;C:接种量;D:装瓶量;E:摇床转速。

微生物合成次级代谢产物的能力与发酵条件紧密相关,其直接影响代谢方式及代谢物产量,从而影响目的产物产量[25]。因此,确定菌株TT207的最适发酵条件,能够大幅提高其EPS产量。经优化,得到菌株TT207的最佳发酵条件为培养时间48 h,培养温度34 ℃,初始pH6.5,接种量4%,装瓶量70 mL/250 mL,摇床转速140 r/min。

2.6 发酵培养基组分的优化

2.6.1 碳源种类及其添加量对EPS 产量的影响 碳源作为细胞生长最重要的能量与营养来源,能够显著影响EPS产量及其化学组成[18]。如图7A所示,菌株TT207可分别利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、甘露醇和可溶性淀粉这7种碳源生长并合成EPS,但蔗糖作为碳源时的EPS产量显著高于其他碳源条件下的EPS产量(P<0.05)。因此,选择蔗糖为最适碳源进行后续研究。

当碳源浓度过低时,不足以提供细胞成长所需的营养,影响细胞生长,从而导致EPS产量降低;但在高浓度下,由于存在碳源阻遏效应[19],影响EPS的合成,只有在适宜的浓度下,细胞生长与碳源阻遏效应达到平衡,菌株合成EPS的能力才会达到最大。如图7B所示,蔗糖添加量在5～45 g/L时,菌株TT207的EPS产量随蔗糖添加量的增大而显著增加(P<0.05)。蔗糖添加量大于45 g/L后,EPS产量增幅减缓。出于后续工业化生产中成本的考虑,选择45 g/L作为菌株TT207的最适蔗糖添加量。

2.6.2 氮源种类及其添加量对EPS产量的影响 氮源作为微生物生长不可或缺的一类能源物质,主要用于微生物的氨基酸、蛋白质和核酸等细胞物质的合成,是微生物生长繁殖及其次级代谢产物合成过程中必需的营养物质。氮源的种类和添加量不仅影响EPS的产量,而且影响其相对分子质量[20]。如图7C所示,菌株TT207可分别利用酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、NaNO3、KNO3、NH4NO3、NH4Cl和尿素这9种氮源生长并合成EPS,但利用无机氮源合成EPS的能力明显高于有机氮源。其中,当KNO3作为氮源时的EPS产量显著高于其他氮源条件下的EPS产量(P<0.05)。因此,选择KNO3为最适氮源进行后续研究。

在高浓度下,氮源供能后生成的铵态氮或硝态氮对菌株具有一定的毒害作用,从而抑制胞外多糖的积累[21]。如图7D所示,KNO3添加量在2～8 g/L时,菌株TT207的EPS产量随KNO3添加量的增大而增加,KNO3添加量为8 g/L时,EPS产量达到最大值,继续增加KNO3添加量,EPS合成受到抑制,EPS产量随之减少。因此,选择8 g/L作为菌株TT207的最适KNO3添加量。

图7 营养条件对EPS产量的影响Fig.7 Nutritional condition on EPS production注:A:碳源种类;B:蔗糖添加量;C:氮源种类;D:KNO3添加量;E:无机盐种类;F:KH2PO4添加量。

2.6.3 无机盐种类及其添加量对EPS 产量的影响 除碳、氮源外,微生物的生长、代谢还需无机盐提供多种重要元素。如图7E所示,菌株TT207可分别利用NaCl、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2、MgSO4·7H2O和FeSO4·7H2O这6种无机盐生长并合成EPS,但在KH2PO4作为无机盐时的EPS产量显著高于其他无机盐条件下的EPS产量(P<0.05)。因此,选择KH2PO4为最适无机盐进行后续研究。

如图7F所示,KH2PO4添加量在2～6 g/L时,菌株TT207的EPS产量随KH2PO4添加量的增大而增加,在KH2PO4添加量为6 g/L时,EPS产量达到最大值。之后,EPS产量随KH2PO4添加量增大逐渐减少。因此,选择6 g/L作为菌株TT207的最适KH2PO4添加量。

2.7 正交实验结果

根据单因素实验结果,初步确定菌株TT207的最佳发酵培养基组分为:蔗糖45 g/L,KNO38 g/L,KH2PO46 g/L;最佳发酵条件为48 h,34 ℃,初始pH6.5,接种量4%,装瓶量70 mL/250 mL,摇床转速140 r/min。因此,在最佳发酵条件下,以蔗糖、KNO3、KH2PO4这三个因素作为实验因子,采用L9(34)设计表进行正交实验,进一步对菌株TT207的发酵培养基组分进行优化。每个实验水平均重复3次,对应的EPS产量取3次实验结果的平均值,结果见表5。根据表5所示极差的大小,可以判断碳源、氮源和无机盐中,对影响EPS产量的主次顺序依次为C>A>B,即KH2PO4>蔗糖>KNO3。

表5 L9(34)正交实验结果Table 5 The results of L9(34)orthogonal test

表6 方差分析结果Table 6 The result of analysis of variance

注:R2=0.980(调整R2=0.921)。

2.7.1 方差分析 方差分析结果如表6所示,碳源、氮源和无机盐三个因素中,KH2PO4对菌株TT207合成EPS的影响显著。综合比较各因素不同水平下的EPS产量,9组实验中的最优组合为A1B3C3,即蔗糖40 g/L,KNO310 g/L,KH2PO48 g/L。根据均值分析,可得出A3B3C3为本实验的最优组合,即蔗糖50 g/L,KNO310 g/L,KH2PO48 g/L。因此,需要进行验证实验,确定菌株TT207合成EPS的最优碳源、氮源和无机盐的组合。

2.7.2 验证实验 验证实验结果如表7所示,在最适培养条件下,组合A3B3C3的EPS产量高于组合A1B3C3,因此确定A3B3C3为菌株TT207合成EPS的最优组合,即蔗糖50 g/L,KNO310 g/L,KH2PO48 g/L。在最佳发酵条件下,菌株TT207的EPS产量达到12.39 mg/mL,较优化前基础培养基培养的胞外多糖产量(1.76 mg/mL)提高了6.04倍。

表7 验证实验结果Table 7 The results of confirmatory

3 结论

本研究从实验室保藏的6株产胞外多糖的沙棘根瘤内生细菌中,筛选出了1株胞外多糖产量较高的菌株TT207,并对其进行鉴定。通过形态学特征观察、生理生化试验结果以及16S rRNA基因序列分析,将菌株TT207鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。为进一步提高菌株TT207的EPS产量,对其培养基组分与发酵条件进行了优化。利用单因素实验,确定菌株TT207的最佳培养基组分为:蔗糖45 g/L,KNO38 g/L,KH2PO46 g/L;最佳发酵条件为:培养时间48 h,培养温度34 ℃,初始pH6.5,接种量4%,装液量70 mL/250 mL,摇床转速140 r/min。在此基础上,通过正交实验设计,进一步优化菌株TT207的发酵培养基组分,并考察各因素对该菌株合成EPS的影响,最终得出培养基组分的最优组合为:蔗糖50 g/L,KNO310 g/L,KH2PO48 g/L。经优化,菌株TT207的EPS产量达到12.39 mg/mL,较优化前提高了6.04倍。研究发现,沙棘根瘤内生枯草芽孢杆菌具有高产胞外多糖的潜力,本文为其工业化生产提供了一定的理论依据和技术支持。但其生物学功能尚未清楚,还需进一步研究探讨。