大蒜降压肽的制备及超滤分离

宋凯强,刘鹏莉,郑振佳,乔旭光

(山东农业大学食品科学与工程学院,山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室,山东泰安 271018)

大蒜(AlliumsativumL.)具有抗氧化、抗菌、改善免疫功能、降血糖、防癌和预防心血管疾病等功效[1-3]。大蒜蛋白的组成有半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸、丙氨酸、精氨酸和天冬氨酸等多种氨基酸[4]。目前将蛋白水解制备成不同种类的活性肽并进行相应的单体制备、结构解析和活性评价是蛋白领域的研究热点[5-10]。

降压肽又称血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制肽,其作用机制主要为降低在肾素-血管紧张素系统中起关键功能的ACE的活性而起到降压效果[11],于1965年首次被Ferreira从蛇毒中发现后[12],在绿豆、乳清蛋白、鱼类和微藻等的酶水解产物中也发现了ACE抑制肽[13-16]。目前市面上常见的降压药均有一定的副作用,如引起哮喘、痛风和双侧肾动脉狭窄等病症[17],而食源性ACE抑制肽因其作用稳定、副作用极小等优点在近年的功能性食品领域中被关注[18]。

超滤是一种以压力差为推动力的膜分离方法,利用超滤膜截留大分子物质,透过小于膜孔径的溶剂和小分子物质的性质来分离物料[19]。因操作过程中节能、环保且易于控制,因而在污水治理、食品加工、医药和治疗等方面已获得广泛应用[20]。因降压肽分子量较小,而酶解产物体系中存在部分降压活性低或无降压活性的大分子物质,所以可通过除去这些大分子物质来富集降压肽,提高降压活性,超滤是最常用的方法[21-22]。超滤膜的膜通量作为膜分离过程中的一个重要工艺参数,影响着处理效率、运行成本和超滤膜的使用寿命,常被选作超滤工艺优化的指标[23]。

本研究以大蒜蛋白为原料,通过酶解方法制备降压肽,研究不同酶的作用效果,优化酶解参数,对酶解产物进行初步分离,探索其对ACE的抑制效果及分离组分的氨基酸组成及分子量分布,为大蒜蛋白质的深度开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大蒜蛋白(蛋白含量为82.36%±0.26%) 实验室自制;ACE 美国Sigma公司;碱性蛋白酶(≥200 U/mg)、风味蛋白酶(≥20 U/mg)、复合蛋白酶(100 U/mg)、胰蛋白酶1∶250(>250 U/mg)、中性蛋白酶(60 U/mg) 北京索莱宝科技有限公司;N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸(N-[3-(2-furylacryloyl)]-L-phenyalanyl-glycyl-glycine,FAPGG)、木瓜蛋白酶(≥3 U/mg)、胃蛋白酶(>3000 U/mg) 上海麦克林生化科技有限公司。

DMJ-60流动分析仪、卷式超滤膜元件 济南博纳生物技术有限公司;SCIENTZ-12N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司;ZW-A型微量振动器 常州智博瑞仪器制造有限公司;DH6000 Ⅱ电热恒温培养箱 天津泰斯特仪器有限公司;SpectraMax M5多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司;L8900型氨基酸分析仪 日本日立公司;DAWN HELEOS II 18角度激光光散射凝胶渗透色谱系统 美国WYATT技术公司;Agilent 1100高效液相色谱仪 美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大蒜降压肽制备用酶的筛选 参考黎观红的方法[24]。参照产品供应商提供的酶最适反应条件:碱性蛋白酶(45 ℃,pH10.5)、风味蛋白酶(55 ℃,pH7.0)、复合蛋白酶(53 ℃,pH8.0)、木瓜蛋白酶(55 ℃,pH7.0)、胰蛋白酶(37 ℃,pH7.6)、中性蛋白酶(40 ℃,pH7.0)和胃蛋白酶(37 ℃,pH1.5),用去离子水配制大蒜蛋白悬浊液(底物浓度为40 g/L),于90 ℃下水浴10 min,超声(功率为150 W,频率为40 kHz)10 min。将其分别于上述各酶的最适反应温度下保温10 min,用0.5 mol/L的盐酸溶液/氢氧化钠溶液调至对应各酶的最适反应pH,向蛋白液中加入酶底比(Enzyme/substrate,E/S)为4%的酶,充分振荡后水浴酶解(反应过程中不断加入标准盐酸溶液/氢氧化钠溶液以保持pH)。分别在反应0.25、0.50、1.00、1.50、2.50、3.50、5.00、6.50 h时取出,于100 ℃下水浴10 min灭酶,冷却,4000 r/min离心10 min,收集上清液测定ACE抑制率。

1.2.2 ACE抑制率的测定 参照Holmquist和Li的方法[25-26],考察ACE抑制率评价降压肽活性。其中,缓冲液和反应物分别为80 mmol/L pH8.3的HEPES-NaOH(含0.3 mol/L NaCl)和缓冲液配制的1 mmol/L FAPGG。

将1.2.1中的各酶解液按1∶30比例加去离子水稀释,分别取40 μL稀释后的酶解液、37 ℃预热15 min的50 μL反应物和10 μL现配制的ACE水溶液(0.1 U/mL),加入酶标板中混合,快速放入酶标仪中测定340 nm下的吸光度,记为c1,将酶标板置于37 ℃培养箱中30 min后,再次测定340 nm下的吸光度,记为c2。空白对照使用40 μL缓冲液代替酶解液,记空白初始的吸光度为d1,30 min后的吸光度为d2,可知空白吸光度的减少量是D=(d1-d2),酶解液孔吸光度的减少量是C=(c1-c2),进而可得所测酶解液的ACE抑制率为:

ACE抑制率(%)=(1-C/D)×100

此外,以ACE抑制率为纵坐标,log待测液浓度为横坐标,进行回归分析可得IC50。

1.2.3 水解度的测定 参考Taylor的方法[27]。取5 mL 1.2.1中的酶解液与50 mL蒸馏水混匀后,以0.1 mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.0。加入10 mL 38%(v/v)甲醛溶液并在室温下放置5 min,以0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH8.5。水解度(Hydrolysis Degree,DH)的计算公式如下,其中,样品总氮经凯氏定氮法(GB 5009.5-2016)测得。

DH(%)=[(V×c×0.014)/N]×100

其中,V为使用0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液的体积(mL);c为氢氧化钠标准溶液浓度(mol/L);0.014为氮毫克当量;N为样品总氮(g)。

1.2.4 大蒜降压肽酶解制备工艺优化

1.2.4.1 单因素实验 固定其他条件pH10.5,底物浓度40 g/L,E/S 4%,考察温度(35、40、45、50、55 ℃)对酶解产物ACE抑制率的影响;固定其他条件温度45 ℃,底物浓度40 g/L,E/S 4%,考察pH(9.5、10.0、10.5、11.0、11.5)对酶解产物ACE抑制率的影响;固定其他条件温度45 ℃,pH10.5,E/S 4%,考察底物浓度(20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L)对酶解产物ACE抑制率的影响;固定其他条件温度45 ℃,pH10.5,底物浓度40 g/L,考察E/S(2%、3%、4%、5%、6%)对酶解产物ACE抑制率的影响。

1.2.4.2 响应面法优化 在单因素考察实验的基础上,以温度(A)、pH(B)、底物浓度(C)和E/S(D)四个因素为自变量,以ACE抑制率为响应值,选择Design-Expert V 8.0.6.1软件的Box-Behnken设计并进行试验。

表1 响应面试验的因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.5 不同分子量降压肽超滤分离工艺的优化

1.2.5.1 不同组分的ACE抑制活性评价 将在1.2.4得到的最佳制备工艺下获得的酶解液调pH至7.0后冷冻干燥,取冻干粉以去离子水配成溶液。在超滤的操作条件为压力0.20 MPa、温度25 ℃、溶液浓度3%时,以截留分子量为3、6 kDa的超滤膜将酶解产物按分子量(Molecular Weight,MW)分离成MW>6 kDa、3 kDa

1.2.5.2 超滤工艺的优化 同1.2.5.1处理得酶解液冻干粉末,配制成不同浓度的溶液进行后续实验。超滤的初始条件为:压力0.20 MPa、温度25 ℃、溶液浓度3%。固定其他条件,以膜通量为评价指标分别考察操作压力(梯度为0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 MPa)、温度(梯度为5、15、25、35、45 ℃)、溶液浓度(梯度为1%、2%、3%、4%、5%)的影响。

1.2.6 氨基酸组成分析 将1.2.5下获得的分离组分冷冻干燥,获得的冻干粉即为测定样品。参照GB 5009.124-2016,以外标法检测样品液中17种氨基酸的浓度。离子交换柱(4.6 mm×60 mm,3 μm),日立专用离子交换树脂,分析周期53 min,分离柱柱温70 ℃,反应柱柱温135 ℃,流动相为茚三酮和茚三酮缓冲液,流速0.35 mL/min,检测波长570 nm和440 nm。

参照GB/T 15400-2018,以高效液相色谱法测定样品中色氨酸的含量。色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱温25 ℃,流动相为乙酸钠缓冲溶液+甲醇(v∶v=95∶5),流速1.0 mL/min,检测波长280 nm。

1.2.7 分子量分布分析 将1.2.5下获得的分离组分冷冻干燥,获得的冻干粉即为测定样品。参照于志鹏等的高效凝胶过滤色谱法[28]。色谱柱Shodex PROTEIN KW-803(8 mm×300 mm,5 μm),柱温40 ℃,流动相为超纯水(含0.02%叠氮化钠),流速1.0 mL/min。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 不同酶处理后产物的ACE抑制活性评价

测得大蒜蛋白的上清液对ACE的抑制率为0.91%,几乎无ACE抑制活性。由图1可知,经7种酶处理后的产物均有不同程度的ACE抑制活性,这说明是大蒜蛋白酶解后产生的肽具有ACE抑制效果。在酶解初期,经碱性蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶处理的产物的ACE抑制活性随时间延长逐渐上升,分别在1.0、3.5、1.0、2.5 h时达到最高,对应的ACE抑制率为68.45%、62.72%、63.51%、59.37%。随着时间的继续延长,ACE抑制率在波动中下降,这与Jiang等[29]研究结果相似。经风味蛋白酶和胰蛋白酶处理后,产物的ACE抑制活性随时间的延长均呈现先上升后逐渐下降的趋势,且均于1.5 h时达到最高,此时ACE抑制率分别为34.11%和69.33%,这与Hanafi等[13]和Zarei等[30]的研究结果较为一致。木瓜蛋白酶的水解产物在0～1.5 h几乎无ACE抑制活性(0～1.18%),随着时间的继续延长而逐渐上升,在6.5 h时达到最高,为27.51%。综合ACE抑制活性、酶解时间、经济成本方面的考虑,选择以碱性蛋白酶制备大蒜降压肽。

图1 不同酶处理后产物的ACE抑制活性评价Fig.1 ACE inhibitory activity evaluation ofgarlic protein hydrolysates prepared with different proteases

2.2 ACE抑制活性和水解度随时间的变化

图2是大蒜蛋白经碱性蛋白酶在温度45 ℃、pH10.5、底物浓度40 g/L、E/S 4%反应条件下,产物的ACE抑制活性和DH随时间的变化曲线。由图2可知,在0～1.0 h内,ACE抑制率随时间的延长而迅速增加,在1.0 h时为12.67%。在1.0～6.5 h,ACE抑制率随时间的延长在波动中下降。在0～1.5 h内,DH迅速增加,之后呈现缓慢上升的趋势,ACE抑制率和DH随时间的变化趋势并不相同。推断其原因为随着时间的延长,ACE抑制肽被继续水解,分解为ACE抑制活性低或无活性的肽片段、游离氨基酸等,因此在水解的后期呈现水解度上升,而ACE抑制率整体下降的趋势[31]。综合ACE抑制率和水解度考虑,选择酶解时间为1.0 h。

图2 ACE抑制活性和水解度随时间的变化Fig.2 changes of DH and ACE inhibitory activity with time

2.3 大蒜降压肽制备工艺的单因素实验

2.3.1 温度对ACE抑制率的影响 由图3可知,ACE抑制率在50 ℃达到最大值(72.74%)后逐渐下降,在35 ℃时最低,为62.54%,原因可能是温度过高使酶的次级键断裂,降低了酶活,因而ACE抑制活性降低,该结果与Li等[26]的研究一致,因此初步选定温度为50 ℃。

图3 温度对产物ACE抑制率的影响Fig.3 Effect of temperature on the ACE inhibitory rate of garlic protein hydrolysate

2.3.2 pH对ACE抑制率的影响 由图4可知,ACE抑制率在pH10.5处达到最高值(68.65%)后逐渐下降,在pH11.5处最低,为60.48%,机理推断为pH的升高影响了酶活性部位的构象、酶和底物分子的解离状态,因而降低了酶活,ACE抑制活性减弱,在对紫菜ACE抑制肽的研究中也观察到类似的变化[31],故初步选定pH10.5进行后续研究。

图4 pH对产物ACE抑制率的影响Fig.4 Effect of pH on the ACE inhibitory rate of garlic protein hydrolysate

2.3.3 底物浓度对ACE抑制率的影响 由图5可知,ACE抑制率在底物浓度40 g/L达到最高(68.83%)后逐渐下降,在20 g/L时最低,为51.39%,原因可能是过高的底物浓度抑制了蛋白酶的扩散,抑制了酶解反应,结合对小麦胚芽蛋白ACE抑制肽的研究结果进行分析[32],初步选定底物浓度为40 g/L进行下一步试验。

图5 底物浓度对产物ACE抑制率的影响Fig.5 Effect of substrate concentration on the ACE inhibitory rate of garlic protein hydrolysate

2.3.4 E/S对ACE抑制率的影响 由图6知,E/S为3%时,ACE抑制率达到最高值(72.01%)后逐渐下降,在E/S为6%时最低,为60.68%,原因可能是随着E/S增加,部分对ACE有抑制作用的肽被进一步酶解为活性低甚至无活性的小肽,参考Huang等[32]研究结果后选定E/S为3%进行下一步研究。

图6 E/S对产物ACE抑制率的影响Fig.6 Effect of enzyme/substrate on the ACE inhibitory rate of garlic protein hydrolysate

2.4 响应面法优化酶解工艺

2.4.1 Box-Benhnken实验设计及结果 以温度(A)、pH(B)、底物浓度(C)和E/S(D)四个因素为自变量,以ACE抑制率为响应值,利用Design-Expert V 8.0.6.1软件中的Box-Benhnken设计响应面试验结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 The design and results of the response surface experimental

表3 响应面二次模型方差分析Table 3 Analysis of variance for response surface quadratic model

注:*表示差异显著(P<0.05);**表示差异极显著(P<0.01)。

2.4.2 回归方程拟合及方差分析 利用Design-Expert V 8.0.6.1软件对2.4.1实验结果处理分析得回归方程:

Y=-1597.16667+37.42A+56.59B+16.51C+39.79D-1.29AB-0.02AC-0.38AD-0.64BC+2.82BD-0.20CD-0.21A2+1.40B2-0.09C2-6.65D2

2.4.3 最佳酶解条件的调整及验证 以Design-Expert V 8.0.6.1软件分析得到大蒜降压肽酶解制备的最佳工艺为:温度49.14 ℃,pH11,底物浓度42.88 g/L,E/S为3.27%,在此条件下,模型预测大蒜蛋白酶解产物的ACE抑制率为84.77%。考虑到实际应用过程中操作方便,将工艺条件调整为温度50 ℃,pH11,底物浓度45 g/L,E/S为3%,在该条件下进行三次重复实验,大蒜蛋白酶解产物实际的ACE抑制率为83.91%±0.13%,与模型预测值的相对误差为1.01%,说明响应面法优化后的工艺可以有效制备大蒜降压肽。该条件下的IC50为(157.87±0.44) μg/mL。

2.5 超滤分离的工艺优化

2.5.1 不同组分的ACE抑制活性评价 超滤技术对大分子与小分子物质的分离效果较好,常用于多肽的初步分离。膜通量因关系到超滤的经济成本、运行能耗等,常被选作工艺优化的指标[23]。

表4 不同超滤分离组分的ACE抑制活性评价Table 4 ACE inhibitory activity evaluation of ultrafiltration separation fractions

注:不同字母表示差异显著(P<0.05)。

以截留分子量为3、6 kDa的超滤膜分离酶解液(按2.4最佳工艺下制备且已调pH至7)得到MW>6 kDa、3 kDa

2.5.2 超滤工艺参数的确定

2.5.2.1 操作压力的确定 由图7知,同一操作时间下膜通量均随压强的升高而增加,分析原因为操作压力的升高使溶液穿过超滤膜的速率增加;同一压强下,膜通量随时间的延长先呈现不同程度的下降后趋于稳定,是超滤过程中产生的浓差极化与膜污染造成的[34],这均与张艳萍等[35]的研究结果相似。0.30与0.25 MPa下稳定后的膜通量相近,分别为7.40、7.20 L/(m2·h),0.10～0.20 MPa时后期膜通量一直较低,范围为(4.35～6.60) L/(m2·h),超滤的总效率不高。考虑实际生产中较高压力下进行长时间的超滤增加了能源消耗和膜污染,选择以0.25 MPa为操作压力,操作时间为25 min时,膜通量为(7.60±0.03) L/(m2·h)。

图7 不同操作压力下的膜通量随时间的变化Fig.7 Flux of membrane changes over time in different operating pressure

2.5.2.2 温度的确定 由图8知,同一操作时间下,膜通量均随温度的升高而增加,这是由于温度升高时,溶液的粘度变小,扩散系数变大,浓差极化现象削弱,因而膜通量随之上升,这与程缘等[36]的研究结果一致。因45 ℃与机器的最高工作温度55 ℃较为接近,还可能引起蛋白质的变性,35 ℃易滋长微生物,而25 ℃接近室温,若用于工业生产上节省了加热料液的能耗且后期膜通量稳定时与35、45 ℃较为相近,25、35和45 ℃对应膜通量6.62、6.80、7.00 L/(m2·h),因此选择25 ℃为超滤温度,操作时间25 min时,膜通量为(6.72±0.26) L/(m2·h)。

图8 不同温度下的膜通量随时间的变化Fig.8 Flux of membrane changes over time in different temperature

2.5.2.3 溶液浓度的确定 由图9知,同一时间下,膜通量随溶液浓度的升高而降低,这是由于当溶液浓度升高时,溶液的粘度变大,扩散系数降低,浓差极化和凝胶层易在膜表面产生,因而膜通量降低,这与朱静静等[37]的研究结果相似。当溶液浓度为1%～2%时,溶液中的肽含量较低,整体的超滤效率不高,当溶液浓度为3%～5%时,后期膜通量相近,3%、4%和5%分别对应膜通量6.60、6.55、6.50 L/(m2·h),但溶液浓度的提高也加重了膜污染,从经济及超滤效率考虑,选择超滤的溶液浓度为4%,操作时间25 min时,膜通量为(6.60±0.13) L/(m2·h)。

图9 不同溶液浓度下的膜通量随时间的变化Fig.9 Flux of membrane changes over time in different solution concentration

2.5.2.4 超滤优化工艺的验证 优化后的超滤工艺为:操作压力0.25 MPa,温度25 ℃,溶液浓度4%,在该条件下进行三次重复实验,膜通量相对较高(操作时间25 min),为7.32 L/(m2·h)。研究建立的超滤工艺可为大蒜降压肽的工业生产提供参考。超滤分离获得的MW<3 kDa组分的IC50为(63.27±0.25) μg/mL。

2.6 分离组分氨基酸组成分析

由表5知,MW<3 kDa组分的单种氨基酸中天冬氨酸和谷氨酸含量很高,分别是21.66、14.12 mg/100 mL,和之前的报道诸多降压肽(如源于鱼类和贝类的)均含有丰富的天冬氨酸、谷氨酸相似[38-39]。疏水性氨基酸含量较高,为32.86 mg/100 mL,与之前研究证实的疏水性氨基酸的侧链可与ACE受体紧密结合,因而ACE抑制活性较强相符[40]。碱性氨基酸和脯氨酸含量分别为17.03、7.10 mg/100 mL,利于降压肽呈现较高的ACE抑制活性[41]。酸性氨基酸含量最高,为35.78 mg/100 mL,与沙丁鱼蛋白的研究(经碱性蛋白酶处理获得的降压肽主要由酸性氨基酸组成)类似[42]。

表5 MW<3 KDa组分的氨基酸组成分析Table 5 Amino acid compositions of MW<3 kDa fraction

注:疏水性氨基酸为Ala、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Tyr、Val,芳香族氨基酸为Phe、Trp、Tyr,酸性氨基酸为Asp、Glu,碱性氨基酸为Arg、His、Lys。

2.7 分离组分的分子量分布分析

MW<3 KDa组分的分子量分布如图10所示。可知1400～1900、1900～2000、2000～2500、2500～2700、2700～3000、3000～4500 Da各部分比例分别为3.70%、3.60%、49.50%、21.50%、15.00%、4.5%,主要集中在2000～2500 Da部分,这与大豆降压肽的研究结果相似[43]。

图10 MW<3 kDa组分的分子量分布Fig.10 Molecular weight distribution of MW<3 kDa fraction

3 结论

本研究确定碱性蛋白酶来制备大蒜降压肽,最佳制备工艺为酶解时间为1 h,温度50 ℃,pH11,底物浓度45 g/L,酶底比3%,此时产物ACE抑制率为83.91%±0.13%,半抑制浓度为(157.87±0.44) μg/mL。通过测定比较不同组分的ACE抑制活性,定位降压肽主要集中在分子量小于3 kDa的组分,对相应的超滤工艺优化后为:0.25 MPa的操作压力,25 ℃的温度,4%的溶液浓度,此时膜通量相对较高为7.32 L/(m2·h),IC50为(63.27±0.25) μg/mL,该组分的氨基酸分析表明天冬氨酸、谷氨酸含量及疏水性氨基酸、酸性氨基酸含量丰富,分子量分布显示2000～2500 Da部分占比最高。通过该研究可以确定大蒜降压肽的酶解制备工艺,有效定位大蒜降压肽的分子量的范围,同时为工业化生产大蒜降压肽提供了技术参考。