白蔹素灌胃治疗及联合放射治疗的鼻咽癌模型小鼠肿瘤生长情况观察

税磊，余文兴

(遂宁市中心医院，四川遂宁629000)

鼻咽癌是临床上较为常见的一种恶性肿瘤。环境的不断恶化、不良生活习惯的影响均使得鼻咽癌的发病率正逐年上升［1，2]，放射治疗(以下简称放疗)是目前临床鼻咽癌的首选治疗方法［2]，疾病进展早期的疗效较为显著，可较好的抑制肿瘤生长，但当疾病进展至后期时约40%的患者会出现肿瘤局部复发、远端转移等不良事件［3]。同时放疗是一种伤害性治疗方法，长期放疗可产生一系列不良并发症，严重影响患者的预后。因此，寻找一种疗效显著、稳定、不良作用轻的化疗药物是目前临床鼻咽癌治疗的研究热点。抑制肿瘤血管生成相关研究是目前肿瘤治疗研究的热点课题之一，内皮生长因子(VEGF)是调节肿瘤血管生成的一个重要因子。增殖细胞核抗原(PCNA)是肿瘤细胞增殖过程中一个重要核抗原，可间接反应细胞增殖的活跃。白蔹素是一种黄酮类化合物，又称二氢杨梅素(DMY)，具有镇痛、祛痰、止咳、消炎等疗效［4]。最新研究［5～7]结果显示，在抗肿瘤方面白蔹素也具有不错的效果，可明显抑制癌细胞的迁移、侵袭，同时促进癌细胞的凋亡，抑制肿瘤多药耐药的发生。目前未见有关白蔹素对鼻咽癌的治疗作用及其相关机制报告。2019年2～4月，我们构建鼻咽癌小鼠模型，观察白蔹素灌胃治疗及联合放疗的鼻咽癌模型小鼠肿瘤生长情况，并探讨白蔹素的可能作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、药物及仪器 50只体质量(19±1)g的雄性清洁级BALB/c(nu/nu)裸小鼠，生产许可证号：SCXK(沪)2008－0016，由上海西普尔－必凯实验动物有限公司。鼻咽癌CNE－2细胞系购自上海细胞生物所。白蔹素，批号17031501，购自国家标准物质网;鼠PCNA抗体及鼠VEGF抗体均购自Sant Cruz公司;RPMI 1640培养基及胎牛血清均购自GIBICO公司。

1.2 鼻咽癌小鼠模型构建 取CNE－2细胞进行体外培养，取生长期细胞悬浮液0.2 mL接种于50只小鼠体内，制备鼻咽癌小鼠模型，造模7 d左右小鼠开始出现肿瘤，出现的时间和肿瘤直径略有差别，最晚于接种后第10天出现，起初均为接种部位出现可触及的绿豆大小的瘤块，并随着时的延长而逐渐增大，每7天测量一次肿瘤直径。接种21 d时有48只鼠肿瘤直径在(200±100)mm3之间，两只肿瘤直径＜100 mm3的鼠予以剔除，最终纳入48只小鼠。

1.3 鼻咽癌模型小鼠分组及白蔹素给予方法 48只小鼠均分为四组，分别为模型对照组、白蔹素组、放疗组、白蔹素+放疗组，每组12只。模型对照组每天生理盐水灌胃，灌胃体积0.1 mL/10 g;白蔹素组每天50 mg/kg白蔹素灌胃，灌胃体积0.1 mL/10 g;白蔹素+放疗组每天50 mg/kg的白蔹素灌胃，灌胃体积0.1 mL/10 g，进行肿瘤局部单次8 Gy照射;放疗组每天灌胃生理盐水，灌胃体积0.1 mL/10 g，然后给予肿瘤局部单次8 Gy照射，各组均干预21 d。

白蔹素+放疗组白蔹素+放疗组1.4各组肿瘤体积、抑瘤率测算 干预1、7、14、21、28 d 时测量肿瘤体积，共测量5次，测量方法如下：用游标卡尺准确测出肿瘤的长直径(a)与短直径(b)，测算肿瘤体积，肿瘤体积=(ab－a2)/6，干预28 d测量肿瘤体积后处死动物，小心剥离肿瘤组织，将肿瘤组织立即浸入足量的10%多聚甲醛溶液中固定，计算各组的抑瘤率(%)，抑瘤率=(1－实验组平均肿瘤体积/模型对照组平均肿瘤体积)×100%。重复3次，取平均值。

1.4 各组肿瘤组织VEGF、PCNA检测 采用免疫组化法。取各组肿瘤组织，10%多聚甲醛中固定24 h，小心切取大小适中的组织于包埋盒中，蒸馏水冲洗后经过梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片后采用免疫组织化学技术检测各组肿瘤组织VEGF、PCNA。结果判定：VEGF表达于细胞质中，阳性细胞光镜下细胞质中有大量棕黄色颗粒，VEGF表达量越多，颜色越深，棕黄色颗粒就越多，每组均于10×40倍镜下随机拍摄20张图片输入IPP彩色病理图文分析系统计算光密度值进行量化分析，最后取平均光密度值进行比较分析，平均光密度值=光密度值之和/面积之和，平均光密度值越大，说明VEGF表达量越高;PCNA表达于细胞核中，阳性细胞可见细胞核被染成棕黄色，每组均于10×40倍镜下随机计数清晰视野中的细胞500个，同时记录棕黄色细胞数，用棕黄色细胞数/500再乘以100%即为PCNA增殖指数，最后取PCNA增殖指数进行比较分析，PCNA增殖指数越高，说明肿瘤细胞增殖越活跃。

1.5 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件进行处理。计量资料以±s表示，组间两两比较采用LSD法，若资料不满足方差分析条件则采用非参数检验进行统计分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肿瘤体积及抑瘤率比较 干预第1、7、14、21、28天时各组小鼠肿瘤体积比较见表1。白蔹素+放疗组白蔹素+放疗组白蔹素+放疗组干预28 d时，放疗组、白蔹素组、白蔹素+放疗组抑瘤率分别为 34.27% ±5.13%、27.93% ±4.75%、48.60% ±6.20%，与放疗组、白蔹素组比较，白蔹素+放疗组抑瘤率高(P均＜0.05)。

表 1 干预 1、7、14、21、28 d 时各组小鼠肿瘤体积比较(mm3，±s)

表 1 干预 1、7、14、21、28 d 时各组小鼠肿瘤体积比较(mm3，±s)

注：与模型对照组比较，*P＜0.05;与白蔹素组比较，#P＜0.05;与放疗组比较，※P＜0.05。

组别28 d白蔹素组 122.82 ±68.29 206.04 ± 79.00 194.23 ±122.87* 187.37 ±25.94* 168.78 ±22.95肿瘤直径干预1 d 干预7 d 干预14 d 干预21 d 干预＊※白蔹素 +放疗组 121.00 ±77.04 204.23 ±112.87 170.37 ±101.94* 141.78 ±54.95* 120.37 ±47.87*#※放疗组 121.94 ±41.62 202.16 ± 84.67 176.84 ± 68.75 156.48 ±20.73 153.93 ±24.03*模型对照组 122.70 ±37.15 222.86 ± 60.29 231.87 ± 64.81 255.26 ±19.49 234.19 ±11.12

2.2 各组肿瘤组织VEGF表达量比较 模型对照组、放疗组、白蔹素组、白蔹素+放疗组肿瘤组织VEGF 表达量分别为0.041 ±0.004、0.017 ±0.004、0.015 ±0.002 和 0.003 ±0.002，与模型对照组比较，放疗组、白蔹素组、白蔹素+放疗组肿瘤组织VEGF表达量降低(P均＜0.05)，放疗组、白蔹素组、白蔹素+放疗组肿瘤组织VEGF表达量两两比较，P 均 ＜0.05。

2.3 各组肿瘤组织PCNA增殖指数比较 模型对照组、放疗组、白蔹素组、白蔹素+放疗组肿瘤组织PCNA增殖指数分别为31.02% ±2.45%、17.04%±2.55%、10.36% ±3.15% 和 9.15% ±1.72%，与模型对照组比较，放疗组、白蔹素组、白蔹素+放疗组肿瘤组织PCNA增殖指数降低(P均＜0.05)，放疗组、白蔹素组、白蔹素+放疗组肿瘤组织PCNA增殖指数两两比较，P均＜0.05。

3 讨论

近年鼻咽癌的发病率越来越高，已成为临床上常见的恶性肿瘤之一。目前临床上治疗鼻咽癌的主要措施为放射治疗，这与鼻咽癌特殊的生物学行为、病理类型以及解剖学结构等因素有关，但是放射治疗仅对早期患者效果明显，并且5年生存率仍然低于60%，对于晚期患者进行放射治疗，5年生存率更低，因为晚期患者在治疗过后很容易出现局部复发或远处转移等并发症，最终导致治疗失败［8.9]，因此降低鼻咽癌患者的复发率和远端转移是目前急需解决的问题之一。在进行放射治疗的时候不仅可以杀死癌细胞，也可以杀死人体正常的组织细胞，特别是对于造血系统损害较大，因此在进行放射治疗后，患者会出现一系列并发症。目前认为鼻咽癌的发生与多个因素有关，包括环境因素、遗传因素、个人生活习惯及EB病毒感染，这些因素都会不同程度导致鼻黏膜纤毛输送功能受损，最终引发鼻咽癌。白蔹素主要活性成分为黄酮类化合物，具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、消炎等多种奇特功效，因此本次研究将其用于联合治疗鼻咽癌，观察其抗肿瘤活性。

众所周知，肿瘤细胞的生长繁殖有赖于新生毛细血管的生成，抑制肿瘤血管生成相关的研究是目前研究的热点课题之一，白蔹素对血管生成具有一定的抑制作用，它是否可以通过这一重要机制来抑制肿瘤细胞的生长目前还不得而知，也未见相关报道。本研究首先探讨了白蔹素与鼻咽癌细胞生长的关系，结果发现它可明显的抑制肿瘤细胞的生长，连续灌胃给药21天进行干预后，对肿瘤细胞的抑制作用与放射治疗无明显差异，并且与放射治疗联合使用时可取得更好的抑制作用，这间接的说明两种治疗措施抑制肿瘤细胞生长的途径不同，同时使用这两种疗法，可以通过不同的机制抑制肿瘤细胞生长，从而提高治疗效果，但是对两种措施进行综合比较后发现，尽管对肿瘤的抑制作用都较好，但是各有其优缺点，放射治疗起效快，但是对患者身体的不良反应较大，白蔹素尽管还未发现明显的不良作用，但是起效慢，需要进行连续21天的大剂量治疗，并且治疗效果尚需及进一步大样本研究。虽然通过本次研究还不能肯定是否可将它应用于临床取代放射治疗来治疗鼻咽癌，但是明确了其在抑制鼻咽癌细胞生长时的效果，为今后的临床应用提供了基础。

调节肿瘤血管生成的一个重要因子就是VEGF，它不仅对血管内皮细胞的增殖分化具有明显的促进作用，而且还可以促进内皮细胞的迁移，这是因为它可以促进，间质胶原酶和金属蛋白酶的生成，由于它具有这些重要的生物学活性，因此它的高表达可以明显的促进肿瘤细胞的转移和浸润，这也是肿瘤细胞发生浸润和转移的一个重要机制，同时也是一个重要的预测因子［10]。通过本次研究发现，白蔹素治疗和放疗均可明显明显减少肿瘤组织中VEGF的表达，对肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用，并且这种抑制作用在联合使用时更强，VEGF的表达也更低，这说明白蔹素抑制肿瘤细胞生长的一个重要机制就是抑制VEGF的表达。

PCNA与肿瘤细胞的DNA合成有紧密的关系，是肿瘤细胞增殖过程中一个重要的核抗原，处于增殖期的细胞核中均有该抗原的表达，他表达量的增高可间接的反应出细胞增殖的活跃。在本次研究结果中发现，模型对照组中肿瘤细胞的PCNA表达量高于其他三组，说明该组的肿瘤细胞增殖活跃，而其他三组通过施加相应的干预措施后，肿瘤细胞的生长增殖受到了抑制，且差异有统计学意义，并且白蔹素治疗和放疗差异无统计学意义，说明二者在治疗鼻咽癌的时候都具有不错的效果，都可以有效抑制肿瘤细胞新生毛细血管的生成，从而发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用，并且这种治疗效果在联合使用时更强。尽管这些机制还不完全清楚，但是有相关研究［11]认为，在进行抗肿瘤治疗的时候正确的使用血管生成抑制剂，可改善肿瘤的微环境，使得异常增生的毛细血管趋于正常，帮助抗肿瘤药物顺利到达靶器官，同时由于肿瘤组织新生毛细血管的形成受到抑制，这也使得肿瘤组织的营养物质和氧的供应受到抑制，从而抑制肿瘤细胞的生长。

综上所述，白蔹素可抑制鼻咽癌小鼠的肿瘤生长，白蔹素灌胃治疗及联合放疗抑制鼻咽癌小鼠肿瘤生长的效果优于白蔹素灌胃。白蔹素的可能作用机制为抑制肿瘤组织PCNA、VEGF的表达。白蔹素、放疗二者可能协同抑制肿瘤组织PCNA、VEGF的表达。本次研究仅初步探讨了白蔹素抗肿瘤活性及其作用机制，但是还需进行更深入的研究来肯定其疗效，同时也需要检测更多的指标来全面分析其作用机制。