生物样本库冷冻组织样本质量评估

倪雅楠，胡颖，王易雪，宋丽洁，陈萌，张连海

(北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所生物样本库，恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京100142)

临床生物样本库主要负责收集、储存、利用和管理人类组织样本，同时配置相应的数据库管理系统，为基础研究人员提供病理类型、肿瘤分期、靶向治疗等相关的样本信息［1，2]。高质量生物样本是精准医疗研究的重要资源，对临床探索新的治疗手段、新药研发配置等具有极其重要的作用［3]。生物样本在应用于科学研究前，需长期保存在生物样本库中，样本质量对于科学研究是否成功起着至关重要的作用，因而标准化、规范化的生物样本质量控制成为了科学研究成功的保障［4，5]。为保证有效的利用宝贵的人类样本资源，确保科研结果的可重复性和比较性，因此生物样本质量控制在生物样本库建设中显得尤为重要。生物样本质量评估是指从分子水平和病理形态等方面对样本进行评价，判断其是否符合生物样本质量标准［6，7]。为保证能为科学研究提供高质量的生物样本，需确定快速而准确的评判方法来判断生物样本是否达到标准［8]。我们观察了反复冻融对生物样本库中冷冻肿瘤组织样本RNA、DNA以及组织病理形态的影响，以此来确定有效的冷冻生物样本质量评估方法，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验样本、试剂及仪器 随机选取我院生物样本库－80℃低温冰箱中冻存的肿瘤组织4例，分别为胃、胰腺、肝、结肠肿瘤组织样本。超低温冰箱(Thermo 88000 Series)、台式离心机(Thermo Heraeus Fresco 21)、RNA Screen Tape、RNA Screen Tape样品缓冲液、RNA Screen Tape Ladder、包埋剂OCT，化学试剂均为分析纯。

1.2 肿瘤组织分组及反复冻融处理方法 分别取4份冷冻肿瘤组织，将同一组织标本平均切分为2份，一份为A组，样本未经冻融，一份为B组，置于冰上完全融化后再次放入－80℃低温冰箱中，反复冻融3次后备用。

1.3 肿瘤组织RNA的纯度、浓度及完整性鉴定取两组肿瘤组织样本，TRIzol法抽提两组样本RNA，并鉴定其纯度、浓度与完整性。提取后的RNA经紫外分光光度计(Nano Drop 2000)检测纯度与浓度，通过OD值(A260/A280=1.9～2.0)判断 RNA 纯度;所提取的总RNA经Agilent 2200分析仪检测，根据检测图像与RNA完整性指数(RNA Integrity Number，RIN)值判定RNA完整性。RNA完整性指数RIN使用10～1反映RNA完整性程度，10为完整性最高，1为降解程度最高［9];RIN≥7视为较高质量的 RNA，可用于基因芯片等的高级别研究［10，11]。

1.4 肿瘤组织DNA纯度、浓度及完整性鉴定 取两组组织样本，按照天根组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA。提取后的DNA经紫外分光光度计检测纯度与浓度，并通过 A260/A280=1.8～1.9判断DNA纯度。DNA样本经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，并根据电泳条带亮度及有无拖尾判定DNA样本完整性。

1.5 肿瘤组织样本病理形态鉴定 取两组组织样本，使用冰冻切片机(Thermo NX70)制作冰冻切片，厚度5 μm，低温保存。HE染色后，通过病理切片扫描仪(Leica Aperio CS2)成像观察样本组织形态，并测算肿瘤部分所占比例。按照国际肿瘤基因组协作研究的意见，肿瘤部分≥80%为合格的肿瘤样本。

1.6 统计学处理方法 使用SPASS20.0统计软件进行处理。计数资料比较用χ2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤组织RNA完整性鉴定 A组胃、胰腺、肝、结肠肿瘤组织 RNA纯度分别为 1.97、1.92、1.95、1.98，RNA 浓度分别为 880.8、853.6、771.9、838.3 ng/μL;B 组胃、胰腺、肝、结肠肿瘤组织 RNA纯度分别为 1.32、1.27、1.85、1.31，RNA 浓度分别为20.0、0.72、687.2、13.4 ng/μL。A、B 两组样本RNA电泳图像及RIN值如图1所示，A组电泳可见清晰的5S、18S、28S 条带，B 组电泳可见 28S、18S 条带发生不同程度降解。A、B两组肿瘤组织RNA纯度、浓度间比较，P 均 ＜0.01。

图1 两组样本RNAAgilent 2200图像及RIN值

2.2 肿瘤组织DNA完整性鉴定 A组胃、胰腺、肝、结肠肿瘤组织 DNA纯度分别为 1.83、1.83、1.86、1.87，DNA 浓度分别为 358.2、462.3、431.0、392.2 ng/μL。B 组胃、胰腺、肝、结肠肿瘤组织 DNA纯度分别为 1.86、1.82、1.85、1.85，DNA 浓度分别为 288.6、397.0、315.5、440.7 ng/μL。两组样本DNA电泳图像如图2所示，A组电泳条带清晰无明显拖尾，B组电泳条带略有拖尾。A、B两组肿瘤组织DNA纯度、浓度间比较，P均＞0.05。

图2 两组样本DNA电泳图像

2.3 肿瘤组织样本病理形态鉴定 两组肿瘤组织病理组织形态如图3所示。A、B两组样本肿瘤组织部分所占比例均＞80%，A、B两组均为合格的肿瘤组织样本(以上检测有经验丰富的病理科技师完成)。

3 讨论

样本质量是生物样本库的核心，高质量的生物样本可为医学科学研究提供可靠的数据来源，确保后续科研实验不受样本质量的影响［13，14]。定期对样本质量的抽检可以验证生物样本库样本收集方式、保存条件及时间对样本的影响，从而进一步寻找提高样本质量的方法［15～17]。目前肿瘤冷冻组织样本是肿瘤转化研究中最有价值的数据来源，分子水平的研究则需要样本能够提供高质量的核酸，因此冷冻样本的质量则成为了冷冻组织生物样本库的核心［16～21]。

图3 各组肿瘤组织病理组织形态

实验从DNA、RNA、组织切片病理形态三个方面比较反复冻融后组织样本分子水平与形态的变化。随机抽取4例肿瘤生物样本，将同一组织样本在低温下均匀切割为两部分，其中A组样本未经冻融，B组样本反复冻融三次后，同时提取RNA测量浓度、纯度，并经Agilent 2200检测RIN值，结果显示，A组样本RNA纯度均在标准范围内(A260/A280=1.9～2.0)，RIN 值均≥7，电泳图像中可见清晰的5S、18S、28S条带，说明RNA质量达到合格标。B组样本中，除肝脏肿瘤组织经反复冻融3次后，组织样本仍能保持较好的质量，但RIN值有所降低;其余样本纯度OD值＜1.4，RIN值均≤5.6，电泳图像中28S、18S条带发生不同程度降解，说明反复冻融三次后组织样本RNA发生不同程度降解。B组样本质量明显低于A组样本;两组肿瘤组织RNA浓度、纯度间比较差异具有统计学意义，说明RNA质量可以很好的反映织样本冻融变化过程中样本质量的变化。同时提取DNA，测量浓度、纯度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，A组样本DNA纯度在标准范围内(A260/A280=1.8～1.9)，电泳条带清晰无明显拖尾，DNA质量达到合格标准;B组样品DNA的OD值也在标准范围内，电泳条带略有拖尾，DNA质量基本符合标准。说明A、B两组DNA质量差别不明显;两组肿瘤组织DNA浓度、纯度间比较差异无统计学意义，说明DNA质量不能很好的反应组织样本冻融变化过程中样本质量的变化。与DNA相比，RNA在样本的收集、处理、存储过程中更易降解，所以RNA的质量更能够体现样本的质量情况，并且可作为衡量样本核酸质量的标准。

病理切片扫描仪成像下，A、B两组样本病理形态未发生明显变化，说明切片法不能反应反复冻融后样本质量的变化，但可通过观察肿瘤细胞含量来判断取材部位是否准确、是否为合格肿瘤组织样本。本研究中两组肿瘤组织含量均达到总组织的80%以上，为合格的肿瘤生物样本。

影响组织样本质量的因素是多方面的，如采集流程、样本离体时间、样本储存条件等等。目前样本库多为存储库，收集的样本需在深低温条件下长时间存储，因此需要建立一套有效、快速的冷冻生物样本质量评估流程。基因组技术是基因筛查、研究肿瘤等疾病中使用的重要技术之一，而基因组技术则依赖于样本核酸的质量。本实验从分子水平出发、评估冷冻组织样本的质量，以及反复冻融对样本质量产生的影响。

DNA是相对稳定的分子，RNA在长期储存过程中会面临着降解的问题，样本在出库过程中需尽量避免核酸、蛋白的降解，出库过程应尽量在较低温度下进行，并避免反复冻融。随着样本库存储样本逐年增多，我们希望寻找到快速有效的方法来确定冷冻组织样本的质量。RNA质量鉴定可以很好地反应冷冻组织样本的质量，通过病理切片观察肿瘤细胞含量的百分比以此确定取材部位是否准确，两者相结合可作为目前冷冻样本质量评估的有效方法之一。样本的质量对于科学研究能否成功起着至关重要的作用，高质量的生物样本可为临床研究提供可靠的数据来源，保证科研结果的有效性、准确性;生物样本的使用过程也是对样本进行检测的过程，因此应收集研究者对于样本的质量反馈信息、建立样本质量反馈机制，根据反馈信息改进样本收集、处理方式等不断提高样本质量。

综上所述，与未经冻融的肿瘤组织比较，反复冻融后肿瘤组织RNA发生不同程度降解，RNA质量降低;DNA质量与肿瘤组织样本中肿瘤部分含量无明显差别，但病理切片可判定取材部位是否准确，RNA质量、与病理切片检测相结合可较好的反应冷冻组织样本的质量情况。