预先给予白藜芦醇苷对TGF－β1诱导生长小鼠肾足细胞株MPC5增殖的影响及其机制

谢志娟，戴新贵，张平，陈建英

(1南华大学附属第一医院，湖南衡阳421001;2湖南省人民医院)

足细胞定位于肾小球基底膜上，对肾小球结构和功能的维持具有重要作用。足细胞的损伤与机械剪切力、凋亡、细胞器氧化应激、炎症因子等因素密切相关。在对足细胞损伤机制的大量研究［1～3]中，复合免疫蛋白NOD样受体热蛋白结构域3(NLRP3)炎症小体是位于细胞内的一种蛋白质复合体，可可通过介导氧化应激、炎症、细胞凋亡、长链非编码RNA信号通路等途径参与调控足细胞的损伤。近年研究［4，5]证实，微小 RNA － 21(miR － 21)介导的信号通路在调控细胞增殖、凋亡与氧化应激中发挥重要作用，也是生物代谢通路的关键靶点。miR－21介导的NLRP3炎症小体活化信号通路可促进肺纤维化的发生、发展［6]。miR－21介导的信号通路是否通过促进NLRP3炎症小体的活化介导足细胞损伤?白藜芦醇苷是一种天然多酚类化合体，具有拮抗氧化应激、炎症、凋亡信号轴的功效［7]。研究［8]证实，白藜芦醇苷可通过介导长链非编码RNA MALAT1信号通路调控炎症介质拮抗动脉粥样硬化。本课题组前期研究［9，10]也证实，白藜芦醇可通过介导miR－21/MAPK/AP－1轴信号通路调控炎症、氧化应激反应，发挥抗肺纤维化的作用。但目前关于白藜芦醇苷对小鼠肾足细胞株MPC5细胞增殖的影响及其相关机制尚不明确，我们推测白藜芦醇苷可能通过调控miR－21介导的信号通路对TGF－β1诱导MPC5的增殖效应与NLRP3炎症小体活化的表达之间有潜在的关联。为此2018年1～10月，我们观察了预先给予白藜芦醇苷对TGF－β1诱导生长小鼠肾足细胞株MPC5增殖的影响，并探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物、仪器及试剂 MPC5(购自中科院细胞库)，10%FBS的 DMEM培养基，放置在37℃ (5℅CO2)细胞培养箱中培养。白藜芦醇苷(纯度约99%)购自西安天一生物技术有限公司。细胞培养箱(Cell Signalin，USA)，冷冻高速离心机及台式冷冻离心机(德国公司生产);超净工作台(苏信净化设备厂);DMEM培养(Sigma－Aldrich，USA);胎牛血清(20%FBS，Gibco，USA);miR －21抑制剂 NSC －211332、TGF－β1(Sigma，USA);SOD及MDA检测试剂盒、二辛可宁酸(BCA)法蛋白质定量试剂盒(Sigma，USA);miR －21、NLRP3、caspase－1及IL－1β等兔多克隆抗体(Santa Cruz，USA);2'，7'－二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH－DA)(Sigma，USA);MTT法细胞增殖检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 MPC5 细胞分组及白藜芦醇苷、TGF －β1、NSC－211332给予方法 取对数生长期MPC5细胞，分为 A、B、C、D 组四组，每组6 个复孔，A、B、C 分别加入 100 μmol/L 白藜芦醇苷预处理 24 h［8，9]。预处理后A组细胞加入100 μmol/L白藜芦醇苷培养2 h，再加入10 ng/mL TGF－β1培养24 h;B组加入30 μmol/L的 NSC－211332培养 6 h，再加入 100 μmol/L白藜芦醇苷培养2 h，再加入10 ng/mL TGF－β1培养24 h;C组加入10 ng/mL TGF－β1培养24 h;D组为空白对照，加入普通培养基。

1.3 各组细胞增殖情况观察 采用MTT法。培养结束时取对数生长期各组细胞，接种于6孔培养板中，加入20 μL的MTT溶液(5g/L)，置于恒温箱孵育恒温(37℃)过夜。加入100 μL的DMSO低频振荡10 min，采用酶标仪检测避光下各组570 nm处的光密度(OD)值。以OD值代表细胞的增殖能力。实验重复3次，取平均值。

1.4 各组细胞氧化应激指标检测 取各组细胞，96孔板中，PBS润洗前后各2次，细胞洗后先加入DCFH－DA，避光37℃孵育约15 min后再次润洗。采用2'，7'－二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFHDA)负载法检各组细胞活性氧簇(ROS);采用硫代巴比妥酸法检测细胞丙二醛(MDA)，WST－1法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)，所有操作均严格按试剂盒说明书进行。重复3次，取平均值。

1.5 各组细胞miR－21及NLRP3、caspase－1及IL－1β蛋白检测 采用Western Blotting法。caspase－1取各组细胞，充分裂解细胞提取80 μg蛋白，BCA法测蛋白浓度，提取等量蛋白质进行电泳(SDS－PAGE)，采用硝酸纤维素(PVDF)电转膜;5%脱脂牛奶封闭1 h，分别加入miR－21、NLRP3、caspase－1及IL－1β一抗4℃孵育过夜，β－Tubulin作为内参;次日用磷酸盐缓冲液洗膜，加二抗在室温下孵育1h。然后用显色(化学发光法)，采集图像(UVP型凝胶图像分析系统)，Image J软件分析目的条带的积分光密度值，以代表目的蛋白相对表达量。重复3次，取平均值。

1.6 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件进行处理。计量资料以±s表示，两组比较采用t检验，多组数据比较采用F检验或单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞OD值比较 A、B、C、D组细胞OD值分别为14.73 ±1.60、12.70 ±1.13、19.31 ±1.79、12.62±1.26，与 D 组比较，C 组细胞 OD 值升高(P＜0.05);与 C组比较，A组细胞 OD值降低(P＜0.05);与 B组比较 A组细胞 OD值升高(P＜0.05)。

2.2 各组细胞MDA、ROS、SOD相对表达量比较各组细胞MDA、ROS、SOD相对表达量比较见表1。

表1 各组细胞MDA、SOD、ROS相对表达量比较( ×103，±s)

表1 各组细胞MDA、SOD、ROS相对表达量比较( ×103，±s)

注：与D组比较，aP＜0.05;与 C组比较，bP＜0.05;与 A 组比较，cP＜0.05。

组别 MDA(nmol/mg) SOD(μ/mg) ROS(AU)A 组 17.73 ±2.08b 202.37 ± 9.15b 1 500.79 ±45.66b B 组 13.44 ±1.20c 217.45 ± 9.77c 812.55 ±40.17c C 组 21.10 ±2.13a 128.46 ± 8.12a 2 118.44 ±50.19a D组12.26 ±1.17 280.33 ±10.19 788.62 ±35.10

2.3 各组 MPC5细胞 miR －21、NLRP3、caspase－1及IL－1β蛋白相对表达量比较 各组MPC5细胞miR－21及、NLRP3、caspase－1及IL－1β蛋白相对表达量比较见表2。

表2 各组MPC5细胞miR-21及NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白相对表达量比较(±s)

表2 各组MPC5细胞miR-21及NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白相对表达量比较(±s)

注：与D组比较，aP＜0.05;与 C组比较，bP＜0.05;与 A 组比较，cP＜0.05。

组别 miR－21 NLRP3 caspase－1 IL－1β A 组 1.33 ±0.11b 0.21 ±0.02b 0.31 ±0.09b 0.93 ±0.17b B 组 0.99 ±0.03c 0.15 ±0.03c 0.18 ±0.08c 0.72 ±0.07c C 组 4.10 ±0.53a 1.16 ±0.12a 1.04 ±0.19a 1.81 ±0.18a D组1.16 ±0.07 0.12 ±0.02 0.06 ±0.01 0.24 ±0.06

3 讨论

足细胞参与稳定肾小球毛细血管，维持肾小球滤过屏障的功能，在糖尿病肾病的发生、发展中扮演重要的角色［3，11]。目前，NLRP3 炎症小体活化及非编码RNA介导足细胞损伤的发病机制已成为研究的热点。NLRP3炎症小体由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白和caspase－1组成［12]。激活的NLRP3招募caspase－1并介导自身寡聚体化诱导活化caspase－1促IL－1β诱发机体炎症反应爆发性释放，同时免疫细胞的激活诱导免疫应答失衡与肾小球足细胞的氧化应激和凋亡紧密相关［13]。研究［13，14]报道，ROS诱导NLRP3炎症小体活化信号通路在糖尿病肾病的发病机制中发挥重要作用。miR－21可介导TGF－β1调控NLRP3/IL－1β/NOX4信号通路促肝纤维化［15]。因此，本研究进一步探讨miR－21是否激活ROS－NLRP3炎症小体系统，破坏氧化还原水平稳态，促进细胞增殖导致MPC5细胞的损伤。据此，可推测miR－21可介导TGF－β1诱导NLRP3炎症小体活化信号通路参与细胞增殖及氧化应激。本研究将miR－21抑制剂NSC－211332预处理TGF－β1孵育的 MPC5，以探讨 miR－21/TGF－β1/NLRP3信号轴对MPC5细胞增殖及氧化应激的影响。结果显示，C组细胞中SOD含量进一步明显下降，MDA、ROS含量及细胞增殖OD值显著升高，也明显促进 miR－21、NLRP3、caspase－1及IL－1β 蛋白的表达。本研究结果也表明，B、C组各指标变化均相反。由此可推测，miR－21可通过介导ROS－NLRP3炎症小体－TGF－β1信号轴影响氧化还原水平的稳态，诱导氧化应激反应及启动细胞凋亡增殖。因此，靶向沉默关键位点miR－21基因后对TGF－β1诱导MPC5细胞的损伤具有保护作用。

白藜芦醇苷是一种药效学多样化的多酚类化合物，是SIRT3的有效抑制剂，具有影响细胞生长周期、参与miRNA诱导线粒体—凋亡的通路、调控内质网应激－自噬途径等多重生物效应［16]。研究［17]发现，白藜芦醇可介导miR－21/STAT3信号通路抑制调节性T细胞改变肿瘤微环境抗肝癌作用;白藜芦醇苷靶向调控miR－21的下游靶基因SIRT1的表达减少ox－LDL诱导细胞内活性氧生成、抑制炎症因子表达及提高抗巨噬细胞增殖的能力［18];白藜芦醇可介导SphK1/AP－1信号通路抑制肾小球系膜细胞增殖［19]。与此同时，本课题组前期研究表明：白藜芦醇通过阻碍细胞周期进展及促进细胞凋亡途径抑制人胚肺成纤维细胞细胞增殖［20];白藜芦醇介导TGF－β1/ADAMTS－1信号通路抑制肺组织炎症反应，并且降解胶原蛋白从而抑制肺纤维化的作用［21]。鉴于白藜芦醇广泛的生物学效应及调控肾小球上皮细胞的病理过程，我们推测白藜芦醇可能参与了对miR－21下游靶基因及miR－21介导TGF－β1诱导NLRP3炎症小体活化信号通路参与细胞增殖及氧化应激的调控。本研究结果发现，白藜芦醇苷干预后，能抑制MPC5细胞增殖，同时抑制miR－21、NLRP3、caspase－1及 IL－1β 等蛋白的表达和ROS、MDA的表达。此外，运用miR－21通路抑制剂NSC－211332阻断miR－21表达，发现白藜芦醇苷抗氧化、协同性抗NLRP3炎症小体活化因子表达的效应加强，且NLRP3表达再次明显下降，进一步证实miR－21通路在TGF－β1诱导MPC5细胞增殖中的作用，同时推测miR－21/NLRP3炎症小体通路介导MPC5细胞增殖造成肾细胞损伤的重要机制。以上结果显示：我们可预测白藜芦醇苷下调miR－21表达调控MPC5细胞氧化应激水平的稳态及抑制NLRP3炎症小体活化的表达起到减轻细胞损伤的作用，但具体分子机制仍需进一步研究探讨及研究。本研究为基于白藜芦醇苷治疗MPC5细胞损伤的靶向治疗方案提供体内初步的实验证据，同时为下一步体外实验相关信号通路奠定了实验基础。

综上所述，TGF－β1可促进MPC5细胞增殖，白藜芦醇苷可抑制TGF－β1诱导的MPC5细胞增殖。其机制可能为下调miR－21表达，增加SOD含量，降低胞内MDA与ROS含量，调控MPC5细胞氧化应激水平的稳态;同时抑制细胞NLRP3、caspase－1及IL－1β蛋白表达，抑制NLRP3炎症小体的活化，减轻足细胞损伤。