主动脉瓣反流合并左心室增大患者外周血差异表达环状RNAs的筛选

文智，谭程，吴建强，洪澜，薛杨，孙小康

(德阳市人民医院，四川德阳618000)

主动脉瓣关闭不全时，左心室容量负荷加重、室壁张力增加。如心瓣膜关闭不全未能及时纠正，左心室继续肥厚和扩大，心肌细胞纤维化，心室壁顺应性下降，导致左心室功能不可逆性损害［1]。心脏超声测量中国40～59岁汉族男性左心室舒张末期内径(LVEDD)正常值为 38.4 ～ 54.5 mm［2]。左心室内径增大是心脏瓣膜手术的独立危险因素，也是生存率的独立预测因子。阻止和逆转主动脉瓣关闭不全患者的左心室重构是目前的研究热点，除从外科手术方面解决原发病因着手外，基因调控心肌细胞的重构层面也是一个研究突破口。文献［3，4]报道，miRNA－233是一种可以诱导心肌肥大的内源性调节子，与心肌重构有关。近年来，随RNA测序技术的广泛应用和基因芯片技术的快速发展，研究［5]发现许多前体mRNA可被非线性地反向剪接或通过基因重排而形成反向首尾连接的环状RNA(circRNA)，circRNA在所有剪接转录本中占有较大比例。circRNA可充当miRNA海绵，竞争性抑制miRNA的转录调控，有效影响miR靶基因活性，发挥转录后调控作用［6]。研究［7]表明，circNRA 不编码蛋白，却在表观遗传学、转录调控及转录后调控等中扮演了重要角色，能在基因组水平及染色体水平对基因表达进行调控;有着结构稳定、丰度高、序列保守性高、组织特异性高等特点［8]。Memczak 等［9]通过对外周全血、组织样本进行 circRNAs检测后，发现血液样本中的circRNAs是稳定且易于检测，全血可作为实验标本来研究circRNA与特定疾病的关系。

我们采用circRNA微阵列芯片技术分析主动脉瓣反流合并左心室增大患者与主动脉瓣反流患者左心室正常患者外周血circRNA表达谱，初步筛选外周血差异表达circRNAs，并寻找预测靶向吸附miRNA223的差异表达的circRNAs，从而筛选出可能参与调控主动脉瓣反流所致左心室增大的circRNAs，为进一步进行阻止和逆转主动脉瓣关闭不全患者左心室重构的研究提供初步依据。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年8月～2018年9月德阳市人民医院心胸外科确诊为主动脉瓣反流合并左心室增大的4例患者(观察组)，均为男性，年龄(51.25 ±6.40)岁，汉族，左心室 LVEDD ＞60 mm;对照组选取同研究期主动脉瓣反流的4例患者，均为男性，年龄(49.5 ±5.26)岁，汉族，左心室 LVEDD 38～55 mm。纳入标准：①心脏彩超提示主动脉瓣关闭不全;②超声测量左心室LVEDD均符合左心室增大的判定标准，其余房室腔测值具有可比性;③符合手术指征且在德阳市人民医院行单纯主动脉瓣置换术：④无高血压、糖尿病、慢性肝肾病、恶性肿瘤、结缔组织病、类风湿疾病;⑤不包括需要手术治疗的其他瓣膜器质性病变、先天性心脏病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、扩张性心肌病。本研究经德阳市人民医院医院伦理委员会审核通过，标本的采集均经过家属授权并签署知情同意书。

1.2 外周血circRNAs检测

1.2.1 标本采集 两组均于术前1日用 PAX-gene®全血RNA管采集外周血5 mL，液氮保存送上海康成生物公司进行芯片检测。

1.2.2 受检标本总RNA的提取与纯化 按照 TRIzol试剂盒(Invitrogen公司，美国)说明，分别提取两组外周血总RNA，利用Buffer RPE反应体系对总RNA进行提纯，使用NanoDropDN－1000分光光度计测定浓度及230、260和280 nm处的光密度OD值，测算 OD260/OD280、OD260/OD230评估纯度，采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳方法检测RNA完整性。两组提取总RNA的OD260/OD280均在2.00左右(1.80～2.10)，OD260/OD230均 ＞2.00，说明总 RNA 纯度较高，电泳后均得到28S、18S、5S三条界限分明、位置一致的条带，说明总RNA完整性较好。两组抽提总RNA符合下一步RNAs基因芯片检测的实验要求。

1.2.3 circRNAs检测 ①cDNA 合成、标记与纯化采用RNA核糖核酸酶去除总RNA中的线性RNA，然后采用环状RNA labeling(Arraystar公司，美国)转录和扩增circRNAs成带有荧光标记的cRNA，并使用RNeasy小型试剂盒(Qiagen公司，德国)纯化标记的 cRNA，NanoDropDN－1000测定被标记cRNA浓度和活性。②芯片杂交将标记后的样品与Human circRNA Array(6×7K)芯片(Arraystar公司，美国)进行排列杂交，然后用Gene Expression Wash Buffer(Agilent公司，美国)进行清洗。③芯片扫描机扫描数据 杂交芯片由Axon GenePix 4000 B(Axon公司，美国)微阵列扫描仪扫描获得芯片图，然后将扫描图像导入GenePixPro6.0软件(Axon)得到circRNAs原始数据。

1.3 统计学方法 使用R软件对原始数据进行分位数归一化，两组芯片数据经归一化处理后，cir-cRNA表达分布情况在8组标本中几乎相同，说明可进行下一步数据分析处理。通过P－value和FDR筛选两组外周血具有统计学意义的差异表达的circRNAs。两个样品间差异表达 circRNAs通过荧光信号强度差异倍数Fold Change(FC)及 P值筛选，差异表达的circRNAs的判定标准为在4例样本中至少有3例出现，以配对t检验P＜0.05，FC值＞2(代表circRNA表达上调或下调)。对芯片筛选出的差异表达circRNA作层次聚类分析，两组外周血circRNAs的表达水平组内一致性高，数据可用。利用 TargetScan［10]和 miRanda［11]两个软件预测差异表达circRNA最可能结合的miRNA，取匹配值较高的5个miRNA，并对这5个miRNA的结合位点进行预测和注释，分析与心肌重构相关miRNA－233有关联的circRNAs。

2 结果

观察组158个circRNA的荧光信号强度FC值均＞2，且与对照组比较，P均＜0.05;其中105个表达下调、53个表达上调，21个circRNAs的FC值＞5。见表1。

表1 观察组中FC＞5的差异表达circRNAs

158个差异表达 circRNAs中，hsa_circRNA_102898(下调，miR－223－3p/miR－612/miR－127－5p/miR－338－5p/miR－624－5p)、hsa_circRNA_101661(上调，miR－223－3p/miR－875－3p/miR－148b－5p/miR－92a－2－5p/miR －689)、hsa_circRNA_103740(上调，miR－362－5p/miR－223－3p/miR－362－3p/miR－622/miR－212－3p)与miRNA－233存在结合位点。

3 讨论

circRNAs广泛存在于全血、血清、血浆、脑脊液、尿液、精液等体液内［12]。Memczak 等［9]对人类全血中的RNA进行测序，结果显示百余种circRNAs的表达量明显高于对应组织的 miRNA。外周血的circRNAs主要存在外泌体中，并以此作为载体在体内运输，外泌体内的脂质分子可以对circRNAs起保护作用，是其结构保持稳定［13]，而且外泌体可以穿过血脑屏障，所以神经系统病变所释放的circRNAs也可以在血液中检测到［14]。Zhao等［15]通过基因芯片分析冠心病患者和健康对照患者血清中的环状RNA发现前者血清环状RNA相较于后者有12种上调、10种下调，进一步研究发现冠心病患者血清中明显上调的hsa_circ_0124644具有最高的灵敏度和特异度，且对冠心病具有更高的诊断价值。Wu等［16]通过芯片分析，发现高血压患者血浆中的circRNAs相对于对照组表达下调的有13种，表达上调的有46种，has_circ_0005870在高血压患者血浆中的表达明显下调，提示其可能是诊断高血压的一种新型生物标志物。

在由左心室负荷增大引起的心室重构的病理过程中，心肌细胞的总数是恒定的，心肌间质蛋白质合成增加，肌节致密重组，导致心肌细胞重构和心功能下降［17]。Zhou等［18]使用 circRNA 芯片筛查糖尿病db/db小鼠心肌中circRNAs表达谱，发现了24个上调和19个下调的circRNAs。在体外实验中，发现circRNA_010567显著上调，生物信息学分预测circRNA_010567可吸附并抑制miR－141的功能，并通过双荧光素酶法测定验 功能实验表明，沉默circRNA_010567的功能可上调miR－141，进而下调TGF－β1表达，并抑制纤维化相关蛋白α－SMA/ColⅠ/ColⅢ的表达。该研究表明，circRNAs通过circRNA－miRNA－mRNA通路在糖尿病小鼠模型心肌纤维化过程中有重要作用。Jakobi等［19]运用二代环状测序技术和DCC软件对鼠科动物的心脏组织 circRNAs进行筛选，发现 Dmd－circRNA、Ryr2－circRNA、Ttn－circRNA可能直接或者间接影响相关的心血管疾病如扩张型心肌病、右室心肌病、心肌肥厚等的发生和发展。本研究结果发现，与对照组比较，观察组共存在158个差异表达circRNAs。158个差异表达的circRNAs中105个表达下调、53个表达上调。158个circRNAs中FC＞5的有21个，表明差异表达的circRNA可能参与了左心室增大病理过程的调控。

miR－233是一种可以诱导心肌肥大的内源性调节子，它可以受多种细胞因子调控，并调控下游的细胞因子，提高心肌细胞内葡萄糖代谢能力，从而促进心肌细胞肥大［4，6，7]。含胱冬肽酶富集功能域的凋亡抑制因子(ARC)是其下游的作用靶点，ARC蛋白是20世纪末发现的在心肌、骨骼肌和大脑等终末分化组织中大量表达的抗凋亡蛋白，在心肌内表达可以起到防止心肌肥大和心肌细胞凋亡的作用。Wang等［20]通过建立的老鼠心衰模型，并发现mm9－circ－012559在心衰老鼠的心脏中含量显著降低，于是将其称为心脏相关性环状 RNA(HRCR)，HRCR可以直接结合 miR－223并充当内源性的miR－233吸附海绵，抑制 miR－223表达、上调ARC表达。因此，可以通过HRCR －miR－233－ARC调控通路，抑制心肌细胞肥大，临床表现上可起到阻止心脏增大和心力衰竭的作用。在本研究中，发现与miR－233存在结合位点的差异表达的circRNA 有 hsa_circRNA_102898、hsa_circRNA_101661、hsa_circRNA_103740。本研究推测这些circRNA可能通过靶向吸附miRNA－233来调控左心室增大病理过程。

综上所述，与主动脉瓣反流无左心室增大患者比较，主动脉瓣反流合并左心室增大患者外周血存在158个差异表达 circRNAs，hsa_circRNA_103245、hsa_circRNA_104014、hsa_circRNA_102617、hsa_circRNA_103421等21个circRNAs表达谱有显著差异。158个circRNAs中105个表达下调、53个表达上调。158个差异表达circRNAs可能与主动脉瓣反流合并左心室增大的发生、发展有关。.hsa_circRNA_102898、hsa_circRNA_101661、hsa_circRNA_103740可能通过与miRNA－233位点结合调控左心室增大。由于本筛选研究纳入标本数量较少，有一定的局限性，还需要大样本的临床验证研究、后期做circRNA与miRNA吸附机制研究及PCR扩增验证来进一步研究加以证实，进一步探讨目标circRNA与左心室增大的关系，深入研究目标circRNA参与左心室增大病理过程的作用机制。