ghrelin对海马神经干细胞糖氧剥夺性损伤的影响及机制

李燕宏，杜坚，张红梅，任柏沉，刘爱东

(成都医学院第一附属医院，成都610500)

ghrelin是一种由28个氨基酸组成的新的内源性脑肠肽，具有促生长激素分泌、调节食欲和调节能量代谢的作用[1]。其作用主要是通过生长激素促分泌素受体1a(GHS-R1a)介导，该受体在脑内广泛分布，提示ghrelin对脑部功能具有重要的调节作用[2]。研究发现，ghrelin对脑缺血-灌注性损伤[3]、创伤性脑损伤[4]、败血症并发脑损伤[5]等均具有抑制作用。神经干细胞具有再生能力和定向分化为神经细胞的潜力[6]，有可能参与中枢神经系统损伤与修复过程[7]。近期研究显示，敲除ghrelin可使小鼠侧脑室的室管膜下区的神经干细胞数量减少，而外源性给予ghrelin则增加神经干细胞数量[8]。ghrelin对脑内神经干细胞的调节作用可能构成其保护脑损伤的细胞学基础，但具体机制并不清楚。核受体辅阻遏子1(N-CoR1)是非配体化核受体的主要结合蛋白。N-CoR1与非配体化的核受体结合，募集并激活组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)，进而抑制靶基因如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的表达[9]。研究发现，过表达N-CoR1被可抑制间充质干细胞向脂肪细胞[10]和成骨细胞[11]的分化，沉默N-CoR1则促进间充质干细胞增殖分化；另外，N-CoR1还调节神经胶质母细胞瘤衍生的癌症干细胞增殖分化过程[12]。但是，N-CoR1是否介导ghrelin对脑内神经干细胞的保护性作用目前尚不清楚。2017年1月～2018年12月，我们制备海马神经干细胞糖氧剥夺性损伤模型，观察N-CoR1/PI3K通路在ghrelin保护神经干细胞损伤中的可能作用，为ghrelin用于中枢神经系统损伤的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 海马神经干细胞：新生C57BL/6幼鼠海马神经干细胞由本实验室参照文献报道[13]分离培养，采用针对神经干细胞标志分子巢蛋白的免疫荧光检测鉴定神经干细胞呈现典型巢蛋白阳性。主要药品及试剂：ghrelin、ghrelin受体拮抗剂D-Lys3-GHRP-6、PI3K抑制剂LY294002、抗N-CoR购自Sigma-Aldrich公司；N-CoR siRNA由锐博生物公司合成，转染试剂Lipofectamine2000、Alexa Fluor 488荧光标记二抗IgG购自Invitrogen公司。CCK-8检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。DAPI、BCA试剂盒、RIPA裂解液购自碧云天生物技术研究所。抗PI3K、抗增殖细胞核抗原(PCNA)、抗Bax、抗Bcl-2、抗GAPDH抗体购自美国Cell Signaling技术公司。

1.2 细胞培养 取生长状态良好的第3代神经干细胞，以1×105/孔接种于24孔板中培养。待细胞融合度达80%左右时，即用于实验处理。

1.3 细胞分组造模与干预处理 将细胞随机分为正常对照组、损伤模型组、ghrelin治疗组、GHRP组、LY29400组、siRNA空白对照组、N-CoR1 siRNA组。正常对照组更换为正常糖含量的培养基，置于37 ℃正常氧含量混合气体的普通培养箱中培养24 h。其余各组细胞行糖氧剥夺处理，即是先将24孔板内培养基更换为无糖DMEM/F12培养基，再将培养板放入含1% O2、5% CO2和94% N2厌氧混合气体的培养箱中，37 ℃缺氧处理3 h；糖氧剥夺处理后，将培养液更换为正常糖含量的DMEM/F12培养基，在通正常氧含量混合气体的37 ℃普通培养箱中继续培养24 h。另外，siRNA空白对照组、N-CoR1 siRNA组行糖氧剥夺处理前1 h，培养液更换为含等量转染溶剂Lipofectamine2000或N-CoR siRNA脂质体(50 nmol/L)的DMEM/F12培养液，转染持续至糖氧剥夺之后的24 h。ghrelin治疗组在糖氧剥夺处理结束后，将培养液更换为含ghrelin(终浓度为100 nmol/L)的DMEM/F12培养基，继续培养24 h。GHRP组、LY294002组在糖氧剥夺处理结束后，均预先给予10 μmol/L D-Lys3-GHRP-6[14]或20 μmol/L LY294002[15]处理1 h，再同时给予ghrelin处理，继续培养24 h。为检测ghrelin对神经干细胞增殖活力的剂量效应关系，CCK-8实验中ghrelin治疗组ghrelin浓度被设置为4、20、100 nmol/L，其余实验中ghrelin浓度均被设置为100 nmol/L。

1.4 细胞增殖活力观察 采用CCK-8法。在药物处理完成后，各组24孔板中每孔保留200 μL培养液，再加入20 μL/孔CCK-8溶液，37 ℃下继续培养2 h。采用酶标仪(美国Bio-Tek公司)检测各孔450 nm处吸光值，以此判断细胞活力。

1.5 细胞中N-CoR1、PI3K、增殖标志蛋白PCNA及凋亡标志蛋白Bax、Bcl-2检测 采用Western blotting法。药物处理过程完成后，收集各组细胞；用RIPA裂解液抽取细胞样本，裂解物经10 %SDS-PAGE分离；电转至PVDF膜，加脱脂牛奶液封闭1 h；加一抗(抗N-CoR、抗PI3K、抗PCNA、抗Bcl-2、抗GAPDH)4 ℃孵育过夜，洗脱；再加HRP联接的二抗抗兔IgG(稀释比1∶500) 孵育1 h，再洗脱；加增强型化学发光试剂，显示目标蛋白条带。扫描蛋白条带图像，利用Image J软件分析各条带的灰度值。Bax/Bcl-2蛋白表达量比值(即凋亡指数)用于衡量细胞凋亡程度，比值越高表示凋亡越强。

2 结果

2.1 ghrelin对糖氧剥脱条件下海马神经干细胞增殖的影响 与正常对照组(0.99±0.07)比较，损伤模型组(0.68±0.03)海马神经干细胞增殖活力降低(P<0.01)；与损伤模型组比较，ghrelin治疗组随着ghrelin作用浓度增高(4、20、100 nmol/L分别为0.69±0.04、0.86±0.06、0.97±0.06)海马神经干细胞增殖活力增高，且20、100 nmol/L ghrelin治疗组与之存在统计学意义(P均<0.01)；与ghrelin治疗组(100 nmol/L)比较，GHRP组(0.69±0.05)、LY29400组(0.67±0.04)神经干细胞增殖活力降低(P均<0.01)。与siRNA空白对照组(0.67±0.05)比较，N-CoR siRNA组(0.97±0.05)神经干细胞增殖活力增高(P<0.01)。

2.2 ghrelin对糖氧剥脱条件下海马神经干细胞PCNA和Bax/Bcl-2表达的影响 见表1。

表1 各组海马神经干细胞PCNA和Bax/Bcl-2表达比较

注：与正常对照组比较，aP<0.01；与损伤模型组比较，bP<0.01；与ghrelin治疗组比较，cP<0.01；与siRNA空白对照组比较，dP<0.01。

2.3 ghrelin对糖氧剥脱条件下海马神经干细胞N-CoR及PI3K表达的影响 见表2。

表2 各组海马神经干细胞N-CoR及PI3K表达比较

注：与正常对照组比较，aP<0.01；与损伤模型组比较，bP<0.01；与ghrelin治疗组比较，cP<0.01；与siRNA空白对照组比较，dP<0.01。

3 讨论

随着当今社会人口的日益老龄化，人群中罹患脑血管意外的老年患者数量不断增加，这势必将增加社会与家庭的经济负担。因此，深入研究各类脑血管疾病(例如脑梗死)的发生机制并探寻合适的防治方法具有重要意义。

脑梗死是指因脑部血液供应障碍，缺血、缺氧所导致的局限性脑组织的缺血性坏死或软化。脑梗死的临床常见类型有脑血栓形成、腔隙性梗死和脑栓塞等，脑梗死占全部脑卒中的80%。脑梗死时，脑部血流的突然停止可导致脑内糖氧剥夺，最终导致神经细胞及其他支持细胞受损，这被认为是脑梗死的重要发病机制[16]。基于此原因，科学家正积极研究通过抑制糖氧剥夺来保护大脑的措施。糖氧剥夺也常被用于体外建立脑梗死模型[17]。事实上，糖氧剥夺不仅会损伤神经细胞，也会损害脑内神经干细胞。本研究结果也证实了这一点，糖氧剥夺抑制了海马神经干细胞的增殖，促进了细胞凋亡。由此可见，脑梗死时脑内神经干细胞也能因糖氧剥夺而受损，失去参与脑梗死后修复作用的能力。靶向改善这些内源性神经干细胞的功能，无疑对梗死后的神经再生具有重要治疗意义。为此，本研究观察了ghrelin对糖氧剥夺性损伤海马神经干细胞的保护性作用。结果显示，ghrelin能显著改善糖氧剥夺性损伤后海马神经干细胞的增殖能力和活力，抑制干细胞的凋亡过程。因此，ghrelin可能对维持脑梗死后神经干细胞的神经再生能力具有一定保护作用。

为了进一步探讨ghrelin保护海马神经干细胞抵抗糖氧剥夺性损伤的细胞学机制，本研究探讨了N-CoR1及其下游靶基因PI3K与ghrelin保护海马神经干细胞作用之间的关系。本研究结果显示，糖氧剥夺性损伤是通过上调N-CoR1和下调PI3K，从而抑制海马神经干细胞的增殖能力和活力，促进神经干细胞的凋亡过程。相反，ghrelin则通过抑制N-CoR1表达和增强PI3K表达，进而增强海马神经干细胞的增殖能力和活力，抑制神经干细胞的凋亡过程。现有研究表明，N-CoR1是骨髓间充质干细胞增殖分化的一个负调控因子[10, 11]。N-CoR1还介导神经胶质母细胞瘤衍生的癌症干细胞增殖分化过程[12]。通过应用N-CoR1 siRNA，本研究则表明N-CoR1调控海马神经干细胞的增殖与凋亡过程。由此可见，N-CoR1在不同来源的干细胞增殖分化过程中均起着关键性作用。另外，N-CoR1的下游分子PI3K调节了骨髓间充质干细胞的增殖分化过程[11]，还介导神经干细胞向神经元的分化。基于上述研究，我们推测，ghrelin对N-CoR1/PI3K通路的调节作用可能与其抑制海马神经干细胞糖氧剥夺性损伤作用相关。

综上所述，糖氧剥夺通过调节N-CoR1/PI3K通路而抑制了海马神经干细胞的增殖和促进神经干细胞凋亡，从而影响其参与脑梗死时神经再生的能力。Ghrelin则通过反向调节N-CoR1/PI3K通路，改善了海马神经干细胞的增殖活力和抑制神经干细胞凋亡，保护了海马神经干细胞。