浅谈药品生产企业高效液相色谱法的规范化应用

北京市药品认证管理中心（100053）张联

高效液相色谱法是20世纪60年代初期在经典柱色谱基础上，借鉴气相色谱发展的经验创立的分离分析技术[1]，可实现对绝大多数有机化合物的分离分析。基本原理是在高压力下，利用不同组分在固定相和流动相之间相互作用力的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质相互分离。高效液相色谱法在药品生产和质量控制中应用广泛，涉及药品鉴别、杂质控制、含量测定等诸多方面，已成为药品检验的主流分析方法。

任何检验检测的目的都是为了获得稳定、可靠、准确和一致性的数据，但影响高效液相色谱法检验结果的因素很多，只有规范使用高效液相色谱法，保证检验方法适合于被检样品，同时确保检验人员有能力规范操作检验方法，才能取得可靠的数据。本文将以高效液相色谱法为中心，结合《药品生产质量管理规范（2010年修订）》、《中华人民共和国药典》（2015年版）（以下简称《中国药典》）以及相关技术性文件的原则要求，从质量体系、检验方法验证以及检验操作等方面进行详述，以促进药品生产企业规范化应用高效液相色谱法，保障药品质量。

1 制药质量体系应涵盖药品检验过程

药品生产企业应建立药品质量管理体系，该体系应当涵盖影响药品质量的所有因素，包括确保药品质量符合预定用途的有组织、有计划的全部活动[2]，当然包括产品检验使用的高效液相色谱法。只有产品检验方法与企业质量体系有机融合并规范使用才能保证检验结果符合数据可靠性的要求。为了实现药品质量，企业应配备充足的检验人员，人员应经过培训、考核和评估，合格后方可上岗；企业高效液相色谱仪操作室的环境应符合《液相色谱仪检定规程》（JJG705-2014）要求；企业应对仪器与试剂供应商进行评估分级，建立合格物料供应商清单并保证物料具有可追溯的适当质量；仪器应经过确认、定期检定并保证仪器在生命周期中保持其验证状态。质量体系的正常运行需要企业定期开展审核评估，对审核发现的缺陷采取纠正和预防措施，每年对检验结果的趋势进行分析，保证检验结果的稳定性。

2 高效液相色谱仪的基本要求

2.1 高效液相色谱仪管理 企业应根据在产产品检验需要配置适宜的高效液相色谱仪，包括自动进样器、高压泵、柱温箱、检测器、计算机（含适当的操作系统）和工作站软件等。文件应明确仪器硬件变更、保养、维修后放行使用或停止使用的要求。新购或已安装仪器关键硬件升级后均应进行安装确认、运行确认和性能确认等工作，确认完成后应进行检定，后续也应满足检定周期要求。高效液相色谱仪应有明确标识，应由授权人员操作仪器，使用时按照检定规程要求进行使用中检查，并应对仪器进行定期清洁保养，仪器的使用日志应记录使用前检查情况、使用情况和日常检查项目。

2.2 高效液相色谱仪相关软件的管理

2.2.1 企业应对计算机操作系统的系统时间进行控制，不能随意更改。工作站软件的用户应实名登录使用，禁止不同人员使用同一账号或同一人员使用不同用户名登录。用户管理中应对密码长度、密码更新周期、允许密码输入次数进行规定以防止非法登录。企业应对使用者的权限进行分组，根据软件使用者的不同需求对软件操作权限进行分配。工作站软件中岗位人员的权限分组应与企业文件规定、检验原始记录一致。高效液相色谱仪工作站软件配置方式目前常用的有三类：单机版，数据以文件形式储存在计算机中；DB版，为数据库形式，可控仪器数量1～4台，数据存放在计算机中，一般采用双硬盘备份；网络版，配备服务器，是DB版的扩展版本，理论上数据存储无限制，可控仪器数量无限制，数据存储在专用服务器中，安全性最好。企业可根据被检样品的需要配置相应仪器，并应在使用前完成计算机化系统验证。

2.2.2 工作站软件审计追踪功能 高效液相色谱仪的工作站软件应开启审计追踪功能，记录系统配置参数、仪器参数和数据分析参数的变更，实现数据审计追踪功能，保证数据的可靠性。企业应定期审核用户权限变更和数据审计追踪系统，重点关注是否存在删除、修改色谱图和数据等不规范行为，包括改变色谱图的峰面积和试验的时间，从多做的数据中挑选符合主观需求的数据，一图多用，以及删除、覆盖或重命名色谱图数据。

2.2.3 数据备份与还原测试 工作站软件中的数据应定期备份，目前分为手动备份和自动备份，手动备份相当于文件存档，在工作站软件日志浏览器中可以查看；自动备份，按仪器说明书执行，可以采用定期定时的异地或A楼B楼备份，企业也可采用第三方软件进行双机热备。企业在进行备份的同时应进行文件的还原测试，证明数据可恢复。

2.3 色谱柱的管理 色谱柱目前普遍使用商品化色谱柱，企业在采购检验标准中推荐的色谱柱时，应对色谱柱进行规范管理，包括色谱柱的采购、编号、首次使用柱效的测定、日常维护以及色谱柱的更换条件等，同时应根据供应商说明书的要求进行储存。色谱柱使用前应关注色谱柱的储存液与待分析样品的流动相之间是否互溶。检验时色谱柱温度会影响分离效果，检验标准中未指明色谱柱温度时系指室温。如检验方法耐用性验证时发现室温变化对色谱柱分离效果影响较大，则应在检验标准中明确给出柱温规定。

附表 推荐的定量分析进样测定序列

3 检验方法的管理

3.1 检验标准的确认 目前我国国家药品标准包括《中国药典》、部/局颁标准和进口药品注册标准，统称为法定标准。通常药品生产企业采用的检验标准均为药品注册批件中的质量标准。一般而言，国家药品标准是对药品的最基本质量要求，对于药品生产企业来说，其出厂内控标准通常高于国家法定标准。所以企业应按照《中国药典》的指导原则，以法定标准为基础，结合企业产品的特点确认具体检验项目及限度要求。

3.2 检验方法验证 任何检验检测均需要通过确认或验证的方式来证明该检验方法的正确性。当企业采用新建立的检验方法、检验方法需要修改变更或采用《中国药典》及其他法定标准未收载的检验方法时，应当对检验方法进行验证[2]。但检验方法的验证结论不是持久永恒的，企业应根据生产或检验的变更进行再验证，并通过对变更的风险评估确定验证的广度和深度。

3.2.1 检验方法验证方式 企业必须与法定标准收载的方法进行比较，并证明它等同于或优于法定方法且必须进行验证。通过实验证明用于检验的分析程序适合于预期用途。检验方法验证应作为验证主文件的一部分，建立目的明确的验证方案，验证内容应包括《药品质量分析方法验证指导原则》[3]中规定的项目，验证方案或报告中应记录每一参数的接受标准和验证结果，最后验证报告结论应经正式批准。对不需要进行验证的检验方法，企业应当对检验方法进行确认，以确保检验数据准确、可靠。

3.2.2 检验方法转移 当检验方法不是由企业实验室自行建立，而是委托其他实验室完成时，两个实验室之间应当完成方法的转移，以证明企业实验室具有实施新方法的能力。在检验方法转移中，方法通常要在不同实验室，不同人员，不同仪器条件下使用，此时应依据实验室和方法的特点选择适宜的检验参数，进行再验证或只对某些检验参数进行验证(部分验证)。转移和接收实验室应该在转移验证开始前就验证参数和可接受标准达成一致，转移实验室应该为接收实验室提供适当的培训。

4 检验操作流程

4.1 检验操作准备

4.1.1 溶液配制 在检验操作中，为减少溶剂峰与色谱峰的畸变，应尽可能使用流动相按照检验标准的要求配制供试品溶液与对照品溶液，正确标识并按要求储存。企业可根据检验需要考察配制的供试品溶液与对照品溶液的稳定性，同时个别产品须控制溶液配制后至进样检验的时间间隔。4.1.2被检样品进样测定序列 在执行检验方法过程中所有的步骤都要验证，包括进样的顺序，推荐的定量分析进样测定序列见附表，企业可根据被检样品酌情调整。验证后的分析程序就是检验样品的准则，只在验证范围之内变动是允许的，否则必须重新进行局部性的验证。系统适用性试验的对照品重复进样应在被检样品检验前进行或在被检样品进样时间隔进样，并应贯穿检验始终包括检验结束时。系统适用性试验如果不符合规定，必须立即停止仪器运作，进行OOS调查，修正后再重新开始。除了系统适用性试验的五针之外，在随后的对照品溶液进样，要把对照品1的试验结果加入，然后再计算相对标准偏差，任何时间，如果偏差过大必须停止运行。在检验的进样测定序列完成后，从开始至结束所有的对照品1的数据，必须拿来计算该进样序列的系统精密度。如果超标，那么整个数据不能使用。若有趋势逐渐超标，应调查原因，并重新进样，之前的数据不可使用但应记录该过程。在检验进行过程中，如果发现有任何偏差，必须立即停止检验操作并开展偏差调查，只有对偏差调查结果采取适当的纠正预防措施后才可继续进行检验操作。

4.2 被检样品检验

4.2.1 色谱系统的平衡 为了得到理想的检验结果，不仅需要有好的实验方法，还需要有严谨的操作过程。企业应按照验证的方法和进样测定序列开展检验工作。色谱系统的平衡工作包括：泵冲洗；进样器冲洗；使用流动相冲洗管路；预热，流动相在低流速下工作直到柱温达到室温或各论规定的温度；色谱柱柱平衡，使用标准规定的已脱气流动相在规定的流速下平衡色谱柱；应检查基线噪声和基线漂移是否在设定值范围内，可使用软件的相应功能键进行基线检查；基线斜率的计算结果应符合要求。

4.2.2 系统适用性试验 检验之前进行系统适用性试验是检验方法的组成部分，用于证明仪器、电子设备、分析操作适合被检样品，参数的选择与检验方法的目的和性质有关，色谱系统常用参数如理论塔板数、分离度、灵敏度、重复性或拖尾因子等。实验室应按验证的方法对色谱系统进行系统适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，以确保试验系统的有效性。必要时可对色谱系统进行适当调整以符合要求，品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余参数可参考《中国药典分析检测技术指南》进行调整，以达到系统适用性试验的要求。仪器或关键试剂变更应再次进行系统适用性试验。不进行系统适用性试验或系统适用性试验失败，则被检样品的检验结果不可接受。当对检验结果产生争议时，仍以法定标准规定的色谱条件的检验结果为准。

4.2.3 数据采集 高效液相色谱仪工作站软件的数据采集一般分为单次运行和实时批处理。数据采集参数包括停止时间、流动相流速、柱温箱温度、检测波长、梯度洗脱不同流动相的比例等，在进样时需输入数据文件名称、采样瓶号和进样体积等信息。实时批处理时批检验表格应符合企业验证的进样测定序列。

4.3 数据分析 企业在对色谱图进行积分过程中的参数设定应与验证过程和文件要求一致，包括叠加峰处理，基线漂移，未分离峰的积分，峰面积的计算，舍弃不需要的小峰等。企业应禁止随意改变峰面积以使检验结果符合标准要求的行为，包括通过调整积分参数的方式改变峰面积大小；通过设置最小积分面积或高度舍弃主观不想要的色谱峰；锁定积分时间程的形式变更总积分面积；违规处理拖尾峰。企业根据产品检验需要可设置手动积分权限，但应对积分权限的使用进行严格控制。

4.4 检验报告 企业应制定检验报告的管理文件，规定色图谱报告模板至少应包括页眉、信息栏、色谱图、峰表、页脚等信息。批准的检验报告、工作站软件中的报告模板应与文件规定一致。

高效液相色谱法是药品生产企业控制药品质量的关键技术，是保证药品质量的关键一环。企业应以专业知识为基础，按照药品生产质量管理规范和数据可靠性的要求，建立科学的制药质量体系。通过体系文件、必要的验证、严格的操作、同步记录等规范化的使用，保证取得的检验数据真实可靠，有效保障药品质量。