双氢青蒿素对宫颈癌U14 裸鼠移植瘤的作用及对免疫抑制分子的影响

李 颖，王 凯，胡 琼

（遵义医学院附属医院，贵州 遵义 563003）

宫颈癌是女性常见的生殖道恶性肿瘤［1-2］，其高发病率跃居女性肿瘤第二位。据统计［3］，全球每年有约50 万新发宫颈癌病例，26 万死亡病例，且主要集中在欠发达国家。虽然宫颈癌细胞学筛选极大的改善了宫颈癌的发现和治疗［4］，但高危型人乳头状瘤病毒（HPV）感染率的提升使宫颈癌发病率逐年上涨［5］。目前，宫颈癌的治疗主要分为手术治疗和同期放化疗，其中手术治疗运用于宫颈癌早期患者，而同期放化疗则主要针对晚期复发性宫颈癌患［6］。同期放化疗虽能提升患者的近期疗效和生存率，然而患者的5 年生存率仅为66%，同时部分患者由于无法耐受顺铂等一线化疗药物的毒副而中途退出治疗［7］。因此急需开发具有良好抗肿瘤活性且低毒副作用的化疗替代药物。近年来，双氢青蒿素（DHA）引起了学者的广泛兴趣，研究发现双氢青蒿素不仅能调节免疫，抑制结肠癌、胃癌等，同时还能逆转某些耐药菌株的耐药性［8-9］。基于此，本研究探讨了双氢青蒿素对宫颈癌U14 裸鼠移植瘤的抑制作用，并分析了其对免疫抑制分子的影响。

1 材料

1.1 动物、细胞株 雌性BALB／c 裸鼠15 只，5～6 周龄，体质量18～22 g ［广东省医学实验动物中心，动物生产许可证号SCXK（粤）2013-0002］。U14 小鼠子宫颈癌细胞（上海复祥生物科技有限公司）。

1.2 试药 双氢青蒿素（重庆通和药业有限公司，国药准字H20050082）；顺铂（齐鲁制药有限公司，国药准字H20073652）。二甲基亚砜（DMSO）、甲醇（百灵威科技有限公司）。DMEM 高糖培养基（上海微科生物技术有限公司）；胎牛血清（上海硕欣生物科技有限公司）；白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-6（IL-6）、转化生长因子β1（TGF-β1）、前列腺素E2（PGE2）ELISA 试剂盒（上海仁捷生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分组、给药 在含胎牛血清（10%）的DMEM培养基中将U14 宫颈癌细胞培养至对数生长期。随后将0.2 mL 密度为5×107／mL 的U14 单细胞悬液注入小鼠左后肢近背部皮下，并以此日为第1 天，观察、记录小鼠移植瘤生长情况。当肿瘤直径≥5 mm 时，随机将小鼠分为对照组（生理盐水，肌肉注射0.2 mL）、顺铂组（腹腔注射2 mg／kg）、双氢青蒿素低、高剂量组（灌胃给药100、200 mg／kg），每组各5 只，1 d／次，连续给药10 d。于第11 天处死小鼠，剥瘤称重。

2.2 检测U14 荷瘤裸鼠生长状况及瘤重 自接种瘤细胞之日起，观察小鼠的精神状态、活动、毛发、皮肤、饮食等一般情况。每隔2 d 称量并记录小鼠体质量，同时对小鼠移植瘤的最长径（L）和最短径（W）进行测量，瘤体积V=0.5×L×W2。处死小鼠当日称取瘤重，抑瘤率=（1-平均瘤重给药组／平均瘤重对照组）×100%。

2.3 检测免疫抑制分子水平 处死老鼠前经摘眼球取血约2 mL，血液静置于室温2 h，1 500 r／min 离心20 min，取上清液并于-80 ℃保存。根据试剂盒说明书分别对IL-4、IL-6、TGF-β1、PGE2进行检测，实验过程中应尽量避免血清样品反复冻融。

2.4 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件进行处理，计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q 检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 双氢青蒿素对U14 荷瘤裸鼠生长状况的影响 接种U14 细胞后4 天左右，小鼠体内成瘤，并伴有局部炎症反应，总成瘤率为100%。给药前各组小鼠的平均肿瘤大小、体质量均无显著差异（P＞0.05）。给药期间，对照组老鼠精神欠佳、进食少；顺铂组小鼠精神萎靡，反应迟缓，食欲低下；双氢青蒿素高、低剂量组小鼠正常进食，精神状态良好。治疗后与对照组比较，顺铂组小鼠体质量明显下降，而双氢青蒿素高、低剂量组明显上升（P＜0.05），见表1。

表1 双氢青蒿素对U14 荷瘤裸鼠体质量的影响（±s， n=5）

表1 双氢青蒿素对U14 荷瘤裸鼠体质量的影响（±s， n=5）

注：与对照组比较，∗P＜0.05；与顺铂组比较，＃P＜0.05

3.2 双氢青蒿素对肿瘤生长的影响 与对照组比较，顺铂组、双氢青蒿素组能显著抑制肿瘤质量和肿瘤体积（P＜0.05），双氢青蒿素低剂量组对肿瘤体积无显著影响（P＞0.05），顺铂组对肿瘤质量、肿瘤体积的抑制作用明显优于双氢青蒿素组（P＜0.05）。给药治疗后，顺铂组抑瘤率最高（59.67%），其次为双氢青蒿素高剂量组（41.15%），而低剂量组则相对较低（26.74%）。见表2、图1。

表2 双氢青蒿素对对肿瘤生长的影响（±s， n=5）

表2 双氢青蒿素对对肿瘤生长的影响（±s， n=5）

注：与对照组比较，∗P＜0.05；与顺铂组比较，＃P＜0.05；与双氢青蒿素低剂量组比较，△P＜0.05

图1 各组裸鼠肿瘤生长情况

3.3 双氢青蒿素对IL-4、IL-6、TGF-β1、PGE2水平的影响与对照组比较，顺铂组、双氢青蒿素组血清IL-4、IL-6 水平差异无统计学意义（P＞0.05），而TGF-β1、PGE2水平显著降低（P＜0.05）；双氢青蒿素高剂量组对TGF-β1、PGE2水平的抑制作用较顺铂组均更显著（P＜0.05）。见表3。

表3 双氢青蒿素对IL-4、IL-6、TGF-β1、PGE2水平的影响（±s， n=5）

表3 双氢青蒿素对IL-4、IL-6、TGF-β1、PGE2水平的影响（±s， n=5）

注：与对照组比较，∗P＜0.05；与顺铂组比较，＃P＜0.05；与双氢青蒿素低剂量组比较，△P＜0.05

4 讨论

宫颈癌是一类由人乳头状瘤病毒反复持续感染而导致的严重危害女性健康的恶性肿瘤，其发病率和死亡率一直直居高不下［10-11］。然而由于其临床症状的隐匿性及早期检测手段有效性的欠缺，致使该疾病分布具有一定的区域性，其中发展中国家的发病率和死亡率占全球80%左右［12］。宫颈癌诊断与治疗指南指出宫颈癌的治疗主要为化疗联合手术和放疗［6］，其中顺铂（DDP）为主要的一线化疗药物。然而顺铂属于周期性非特异性抗癌药物，其非选择性特性导致其不仅能与肿瘤细胞的DNA 结合，同时还与血清蛋白、谷胱甘肽、半胱氨酸等还原性生物分子结合，从而对正常细胞产生毒性，最终表现为肾毒性、肝毒性、神经毒性等多种不良反应［13］。因此，开发新作用机制、低毒性的抗肿瘤药物刻不容缓。双氢青蒿素（DHA）是抗疟疾倍半萜内酯药物青蒿素的体内活性代谢物。研究发现［8-9，14］，双氢青蒿素不仅具有较好的抗疟疾、抗病毒活性，其对肿瘤如肝癌、结肠癌、乳腺癌等均有抑制作用，甚至还能逆转耐药肿瘤细胞的耐药性。故本研究探讨了不同剂量双氢青蒿素对宫颈癌裸鼠移植瘤的作用，并对相应的免疫抑制分子表达水平进行了分析。

小鼠体内肿瘤生长结果显示，顺铂组和双氢青蒿素治疗组的实体瘤瘤重低于对照组，其中顺铂组瘤重下降最为明显，而双氢青蒿素高剂量治疗组实体瘤重显著低于低剂量治疗组（P＜0.05），与之相应的顺铂组的抑瘤率最高（59.67%），双氢青蒿素高剂量组的抑瘤率（41.15%）高于低剂量组（26.74%），表明顺铂和双氢青蒿素对宫颈癌移植瘤有抑制作用，且双氢青蒿素的抑制作用呈现剂量依赖性。Hu 等［15］报道双氢青蒿素在体外能够显著诱导宫颈癌Hela 和Caski 细胞凋亡［（80.30±6.01）%、（83.32±3.28）%；（11.39±2.32）%、（12.17±2.89）%］。

在肿瘤的发生发展过程中可分泌多种免疫抑制分子，这些免疫抑制分子促使免疫细胞不能及时有效地识别并清除肿瘤细胞，造成肿瘤细胞免疫逃逸而降低肿瘤治疗有效率。因此，本实验进一步探究了双氢青蒿素对宫颈癌移植瘤小鼠体内免疫抑制分子IL-4、IL-6、TGF-β1和PGE2水平的影响。

IL-4 作为免疫调节分子参与多种生理过程，可抑制Th1 细胞产生，促进免疫抑制分子IL-10 产生，致使机体自我免疫功能被抑制［16］；IL-6 是一类促炎因子，能抑制T 淋巴细胞、抑制自然杀伤细胞，同时诱导Th2 细胞漂移、IL-10 分子分泌，从而促进肿瘤细胞的生长［17］。与对照组比较，顺铂和双氢青蒿素治疗组小鼠血清IL-4、IL-6 水平未见明显变化，表明双氢青蒿素对这2 种分子水平无调节作用。

TGF-β1是一类与肿瘤息息相关的息息相关的分子，在肿瘤初期能上调细胞周期蛋白激酶抑制剂水平而抑制肿瘤生长，但随着肿瘤的发展，TGF-β1则通过抑制T 细胞、诱导Th2 细胞漂移、抑制自然杀伤细胞功能而促进肿瘤生长［18］；PGE2是花生四烯酸经环氧合酶催化生成的脂质代谢物［19］，具有与TGF-β1相似的免疫抑制机制。结果显示，顺铂组和双氢青蒿素组血清TGF-β1和PGE2水平均显著低于对照组，然而顺铂组TGF-β1水平均明显高于双氢青蒿素高、低剂量组（P＜0.05），而顺铂组PGE2水平虽与双氢青蒿素低剂量组无统计学差异（P＞0.05），但仍然呈现上升趋势，表明顺铂对小鼠免疫可能存在损害，而双氢青蒿素则可能一定程度上逆转免疫损害情况。该结果与Zhao等［20］研究类似，即在一定剂量时双氢青蒿素能影响T 细胞功能，同时双氢青蒿素能调节TGF-β ／Smad 途径而达到抗炎活性。炎症是肿瘤发生发展中主要的表现症状，双氢青蒿在逆转炎症微环境的同时，下调TGF-β1和PGE2水平，从而增强机体的免疫应答，使机体的免疫分子能及时有效的识别并清除肿瘤细胞，最终达到治疗肿瘤的效果。

综上所述，双氢青蒿素能抑制宫颈癌U14 小鼠移植瘤的生长，可能通过抑制TGF-β1和PGE2等免疫抑制分子而产生作用。它是青蒿素的体内活性代谢产物，具有口服生物利用度高、毒性小等优点，可作为潜在抗宫颈癌化疗替代药物。然而，本研究还存在小鼠样本较少、机制研究不够全面等局限性，对于双氢青蒿素的具体作用机理还需进一步实验探究。