黄芩苷对高糖致大鼠腹膜组织TRAF6、NF-κB 表达的影响

甘 平，朱丹莉

（贵州医科大学附属医院肾内科，贵州 贵阳 550004）

终末期肾脏病治疗方法包括肾脏替代治疗（RRT）及肾脏移植，而肾脏替代治疗仍是目前治疗终末期肾脏病（ESRD）的主要手段。腹膜透析是终末期肾脏病患者肾脏替代疗法之一，但长期腹膜透析易导致腹膜纤维化（PF），最终使腹膜超滤失败，成为腹膜透析患者退出腹膜透析（PD）的主要原因。影响腹膜纤维化的主要原因为反复发生的腹膜炎和生物不相容性因素损伤，如高葡萄糖、高渗、低pH 及葡萄糖降解物。而含葡萄糖的腹膜透析溶液仍然广泛用于腹膜透析患者。腹膜透析溶液中的高葡萄糖是腹膜炎症和腹膜纤维化的主要原因之一［1-2］，反复暴露于高糖或其他生物不相容的腹膜透析液中扰乱了腹膜损伤和修复之间的平衡，并导致炎症、纤维化和腹膜功能损伤。黄芩苷为黄芩根中提取分离出来的一种黄酮类化合物［3］，具有抗炎抑菌、抗氧化、抗纤维化、抗肿瘤等药理作用［4-9］。黄芩苷在对肝脏、肺、肾脏及动脉粥样硬化的抗纤维化作用中起到显著作用［7，10-13］。还有研究发现，黄芩苷有可能通过其抗氧化作用部分抑制实验性腹膜纤维化［14］。本实验观察黄芩苷对高糖致大鼠腹膜组织TRAF6 与NF-κB 蛋白表达的影响，探讨其在腹膜慢性炎症发病机制中的可能作用。

1 材料

1.1 动物 健康雄性SD 大鼠60 只［动物生产许可证号SCXK（黔）2012-0001］，鼠龄10 周，体质量200～250 g。

1.2 试药 4.25%腹膜透析液（美国百特公司）。脂多糖（LPS 美国Sigma 公司）；黄芩苷（含有量≥98% 北京索莱宝科技有限公司）。兔抗鼠NF-κB p65 抗体、兔抗鼠α-SMA抗体、兔抗鼠TRAF6 抗体（武汉博士德公司）；HE 染色试剂盒、Masson 染色试剂盒、免疫组化试剂盒、蛋白质分子量Marker、DAB 显色试剂盒（南京建成生物工程研究所）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥生物公司）；蛋白裂解缓冲液（北京天恩泽有限责任公司）。

2 方法

2.1 分组、给药 60 只大鼠随机分为对照组、模型组、黄芩苷组，每组20 只。对照组大鼠每天腹腔注射生理盐水20 mL；模型组大鼠每天腹腔注射4.25% 葡萄糖腹透液20 mL，在第1、3、5、7 天时注射用4.25%腹透液稀释为0.6 mg／kg 的脂多糖；黄芩苷组大鼠每天腹腔注射4.25%葡萄糖腹透液20 mL，在此基础上灌胃给药黄芩苷混悬液100 mg／kg，1 次／d，在第1、3、5、7 天注射用4.25%腹透液稀释为0.6 mg／kg 的脂多糖。常规饲养SD 大鼠，实验周期为8 周。

2.2 标本取材 于实验最后1 天给予4.25%腹透液20 mL灌入腹腔后保留4 h，处死所有大鼠，吸取腹腔液，混匀用于白细胞计数；避开穿刺部位，留取壁层腹膜组织10 mm×5 mm×3 mm 大小，4%甲醛溶液固定12 h 以上，另外部分放入-80 ℃冰箱保存，分组做好标记。红细胞裂解液裂解红细胞，用改良Neubauer 计数法计数腹腔液白细胞数目，超过3 000／mL 的大鼠为并发感染，退出实验。

2.3 HE 染色和Masson 染色 取石蜡包埋的壁层腹膜组织，作5 μm 切片，常规方法行HE 和Masson 染色，光镜下观察病理改变。

2.4 Western blot 检测

2.4.1 提取组织蛋白及蛋白定量 取出保存在-80 ℃冰箱中的适量腹膜组织，置于预冷的研钵中混合液氮进行快速研磨，接着将粉末装入之前预冷好的EP 管中，分别添加细胞裂解液50 μL 后放置冰上20 min。置于4 ℃低温离心机以10 000 r／min 离心10 min，留取上清液于预冷的EP 管中备用，使用BCA 法进行测定蛋白含量，将剩余蛋白样品存放于等体积的2×SDS 上样缓冲液中，沸水煮5 min。

2.4.2 制胶及上样 制备10%SDS-PAGE 分离胶溶液，混合好后存放于边条厚度为2 mm 的垂直制胶架上，待胶体呈固态状时，用吸水纸对胶体进行干燥处理。缓慢注入5%浓缩胶后插入加样梳，常温下静置。使用凝胶电泳仪对处理好的能够达到实验标准的凝胶进行垂直固定，添加电泳缓冲液，去除加样梳，并使用电泳缓冲液对其进行清洁。分别取40 μg 蛋白量的组织总蛋白样品，加入样品缓冲液，混合后放置沸水中煮5 min 使蛋白变性。把配置好的样品溶液放置于浓缩胶的上样孔内，作为实验数据收集的对象，向其中加入10 μL 蛋白分子量Marker。

2.4.3 电泳 接通凝胶电泳仪电源，初始电压设置为80 V。待溴酚蓝染料的前缘开始分离胶中上缘后，把电压提升至100 V，继续电泳直至溴酚蓝泳出分离胶的下缘，此过程中保持电压输出稳定。

2.4.4 蛋白质的电转移和膜封闭 利用半干电转移仪进行蛋白质的电转移。电流稳定在30 mA，电转时间为90 min。转移结束后，PVDF 膜取出标记膜的方向。接着用5%TBST 脱脂奶粉密封，常温下进行充分振荡60 min。

2.4.5 抗原抗体反应及显影 使用TBS-T 漂洗液对PVDF膜进行清洗，将膜移入杂交袋中，放入适当漂洗液稀释的抗体，封口，4 ℃孵育过夜；再次用大量TBS-T 漂洗液洗膜，使用新的杂交袋存放PVDF 膜，放入漂洗液稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗；将PVDF 膜置ECL 混合液中于室温下振荡温育5 min。把PVDF 膜片放置在X 光片盒中同时使膜片吸附蛋白面朝上，将X 光片进行感光处理，接着对处理后的胶片进行显影，待影像清晰后使用水冲洗，待胶片干燥保存，借助IPP 软件对图象的目的条带进行灰度分析。

2.5 统计学分析 采用SPSS 17.0 软件进行处理，数据以（±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，多组间的两两比较采用Tamhane’s T2（M）检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 实验动物转归 8 周时，60 只大鼠均无死亡，各组大鼠均出现不同程度的活动减少及迟钝现象，以模型组最为明显。检测腹腔液未发现大鼠发生感染。

3.2 大鼠壁层腹膜组织病理学形态 光镜下对照组大鼠的壁层腹膜可见一层扁平腹膜间皮细胞覆盖，间皮下基质薄，少许纤维细胞及炎症细胞；模型组腹膜间皮细胞成柱形、圆形，部分已脱落，腹膜间质中有大量炎症细胞、成纤维细胞及新生血管浸润，腹膜结构紊乱，间皮下结缔组织厚度明显增加；黄芩苷干预后，腹膜炎症细胞及成纤维细胞较模型组明显减轻，见图1。

图1 大鼠壁层腹膜组织病理学形态（HE，×400）

与对照组比较，模型组腹膜间皮细胞下显示大量胶原纤维沉积，腹膜明显增厚（P＜0.05）；与模型组比较，黄芩苷组腹膜胶原纤维沉积厚度显著减少（P＜0.05）。见图2～3。

图2 大鼠壁层腹膜组织病理学形态（Masson，×400）

3.3 大鼠壁层腹膜组织免疫组化 与对照组比较，模型组增厚的腹膜组织中TRAF6、NF-κB、α-SMA 阳性细胞数目明显增多，黄芩苷组三者阳性细胞数介于对照组及模型组之间。见图4～6。

3.4 大鼠壁层腹膜组织TRAF6、NF-κBp65、α-SMA 蛋白表达 与对照组比较，模型组TRAF6、NF-κB p65、α-SMA表达显著增加（P＜0.05）；黄芩苷作用后，TRAF6、NFκBp65、α-SMA 表达显著减少（P＜0.05）。见表1、图7。

图3 大鼠Masson 染色胶原沉积厚度

4 讨论

持续性不卧床腹膜透析（CAPD）是终末期肾脏病（ESRD）患者肾脏替代治疗的手段之一。但在持续性不卧床腹膜透析期间，反复接触生物不相容性PD 液和反复发作的腹膜炎，腹膜不可避免地经历慢性病理变化，如腹膜间皮细胞柱状改变及脱落、炎症细胞及新生血管浸润、间质纤维化及钙化等［15］。一般发生在持续性不卧床腹膜透析治疗3～4 年以上，且随时间延长而逐渐恶化。Heimbugerr 等报道腹膜透析患者3 年超滤失败发生率为9.5%，6 年患者超过30%，Kawaguchi 等［16］报道在日本腹膜透析超过8 年者，超滤失败达到51%。到目前为止，慢性腹膜纤维化的发生机制尚不清楚，且无有效阻止或延缓其发生的手段。

图4 大鼠TRAF6 蛋白表达（×400）

图6 大鼠α-SMA 蛋白表达（×400）

表1 腹膜组织中TRAF6、NF-κB p65、α-SMA 蛋白表达（±s， n=20）

表1 腹膜组织中TRAF6、NF-κB p65、α-SMA 蛋白表达（±s， n=20）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

图7 大鼠壁层腹膜组织TRAF6、NF-κB p65、α-SMA 蛋白表达

TRAF6 是含有C 端TRAF 结构域的TRAF 家族的蛋白质，由卷曲螺旋和高度保守结构域组成［17］，可以通过介导不同的信号通路来调控炎症反应及细胞凋亡。研究表明，TRAF6 具有控制IKK 和NF-κB 活化的泛素连接酶活性，在经典的NF-κB 激活途径中，TRAF6 泛素化后与细胞质中的TAK1 ／IKK 激酶形成复合物并被其激活，导致IκBа 的降解，使NF-κB 转移到细胞核中进行转录调控［18-20］。NF-κB作为重要的炎症因子，其信号转导参与各种炎症和免疫应答过程［21］，特别是在腹膜纤维化过程中［22］。最新研究发现［23］，在高糖诱导的腹膜损伤的过程中，NF-κB 的活化部分由TLR4 ／MyD88 信号级联介导启动先天免疫应答，引起炎症并且促进腹膜纤维化的发生和进展。

黄芩苷为一种黄酮类化合物，具有多种生物活性，特别是在调节炎症、氧化应激、抗纤维化方面，对心血管系统、消化系统、神经系统以及泌尿系统等疾病起到一定的治疗作用［4-9］。近年来，研究发现黄芩苷在抗纤维化方面有着显著作用，有可能抑制细胞因子，如血小板源生长因子-β（PDGF-β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β1（TGF-β1）受体表达促进大鼠抗肝纤维化的作用［10］。Huang X 等［11］研究发现，黄芩苷可能通过增强A2aR 来下调TGF-β1 诱导的ERK1 ／2 信号通路，有效地抑制博莱霉素诱导的特发性肺纤维化（IPF）中的组织病理学和超微结构损伤。最新研究中，黄芩素可能通过抑制磷酸肌醇-3-激酶／Akt（PI3k ／Akt）途径诱导肌成纤维细胞凋亡来改善肾间质性纤维化［12］。Kitamoto 等发现，sairei-to 主要成分为黄芩苷，有可能通过抑制磷酸二酯酶活性发挥抗氧化作用部分抑制腹膜纤维化［14］。但黄芩苷对抑制腹膜纤维化的相关作用机制尚未完全阐明。在缺血性神经元损伤、气道上皮细胞炎症、结肠炎等引起慢性炎症的动物模型组中，黄芩苷可抑制TLR2／4 及NF-κB 信号通路的活化进而达到抗炎作用［8，24-25］。而慢性炎症反应是导致腹膜纤维化重要原因之一［26］。

本实验结果表明，使用黄芩苷治疗后，TRAF6、NF-κB的阳性表达明显低于模型组。此外，α-SMA 作为腹膜间皮细胞转化为肌成纤维细胞的特异性标志物，在正常腹膜中，间皮细胞不表达α-SMA。当发生病理变化后，可见腹膜间皮细胞及肌成纤维细胞表达α-SMA，本实验中对照组可见少许α-SMA 阳性表达，模型组中可见大量α-SMA 阳性表达在肌成纤维细胞及新生血管中，而黄芩苷治疗组中阳性表达明显减少。表明黄芩苷可抑制TRAF6 表达，调控NFκB 通路，使腹膜慢性炎症减轻，从而减缓腹膜纤维化达到改善腹膜结构及功能的作用。