樟芝三萜酸机械化学提取工艺的优化

何荣军，许 鹏，董 要，张 岳，苏为科∗

（1.浙江工业大学海洋学院，浙江 杭州 310014；2.浙江工业大学，长三角绿色制药协同创新中心，浙江杭州 310014）

樟芝Antrodia cinnamomea又名樟菇、血灵芝、灵芝之王等［1］，是20 世纪90 年代在台湾发现的药用多孔菌，寄生于台湾特有的保育类树种——牛樟树Cinnamomum kanehirai上［2］，具有抗癌、保肝、抗炎、免疫调节、神经保护等药理作用。目前，从樟芝中分离得到的化学成分已超过200 种，包括烷醛、芳香烃、羧酸、脂肪酸酯、腺苷、精油、多糖、三萜等，其中三萜类主要活性物质［3］，但其传统提取方法得率低下，提取时间长，并使用大量有机溶剂，从而污染环境。

响应面法是采用多元二次回归方法优化实验条件，刘军海［4］用该方法优化了白术多糖提取工艺。1919 年，德国研究人员Ostwald 初次提出了由机械力诱发化学反应的概念，近几年来机械化学越来越多地被应用到植物有效成分提取中［5-8］。为了提高樟芝三帖酸提取效率，本实验采用Box-Behnken 响应面法优化该成分机械化学提取工艺，以期为其开发利用提供参考。

1 材料

1.1 试药 红樟芝，培养时间7 个月，由浙江利民药业有限公司提供，粗粉（过40 目筛）备用。熊果酸对照品购于中国食品药品检定研究院。氯仿、冰醋酸、碳酸钠、碳酸氢钠、浓硫酸、浓盐酸、高氯酸等均为国产分析纯。

1.2 仪器 PM 200 行星式球磨仪，配置50 mL 不锈钢球磨罐、10 mm 不锈钢球磨珠（德国Retsch 公司）；Agilent 1200 series 高效液相色谱仪，配置Inertsi ODS-3 反相柱（4.6 mm×25 mm，5 μm）、DAD 检测器（美国Agilent公司）。

2 方法

2.1 三萜酸含有量测定 以熊果酸为对照品，香草醛-冰乙酸法测定含有量。精密称取熊果酸对照品2.0 mg，乙醇溶解并定容至10 mL 量瓶中，得0.2 mg／mL 相应溶液，精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL 试管中，不足1 mL 的乙醇补至1 mL，于100 ℃水浴上蒸干，加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.4 mL，振摇使其充分溶解混匀，然后加入1.0 mL 高氯酸溶液，振摇混匀，于70 ℃水浴显色反应15 min，冰水浴冷却5 min，流动自来水调节至室温。各试管加入5 mL 冰乙酸稀释，振荡摇匀，15 min 后进在545 nm 波长处测定吸光度。以吸光度为横坐标（A），溶液质量浓度为纵坐标（Y）进行回归［9］，得方程为Y=0.125A-0.010（R2=0.998 0）。

2.2 药材提取 称取药材粗粉5.0 g 于球磨罐中，加入固相试剂（NaHCO3或Na2CO3），混匀，加入占球磨罐体积1／3 的球磨珠，于球磨机中球磨，然后粉末转移至圆底烧瓶中，加入水搅拌提取，4 700 r／min 离心10 min，取上清液，再加4 倍上清液体积的95% 乙醇，4 ℃下静置过夜，再次离心，上清液浓缩后调pH 至2～3，氯仿萃取3 次，合并氯仿层。

2.3 三萜酸得率计算 提取液用乙醇稀释到一定浓度后，过0.45 μm 尼龙膜，按“2.1”项下方法测定，计算得率Y，公式为，其中C为三萜酸质量浓度，N为稀释倍数，V为提取液体积，M为樟芝质量。

2.4 工艺优化 在料液比1∶30，50 ℃下提取30 min 的条件下，考察各机械球磨参数的影响。固相碱类型：球磨20 min，转速300 r／min，固相碱用量占原料质量的10%，考察硅胶、Na2CO3、NaHCO3对三萜酸得率的影响。转速：NaHCO3用量占原料质量的10%，球磨20 min，考察200、250、300、350、400、450、500 r／min 对三萜酸得率的影响。球磨时间：NaHCO3用量占原料质量的10%，转速300 r／min，考察球磨5、10、15、20、25、30 min 对三萜酸得率的影响。固相碱用量：球磨20 min，转速300 r／min，考察0、5%、10%、15%、20% 固相碱对三萜酸得率的影响。

在单因素试验基础上，选择球磨转速（A）、球磨时间（B）、助磨剂（固相碱）用量（C）作为影响因素，每个因素3 个水平，采用Box-Behnken 响应面法进行优化。因素水平见表1。

表1 因素水平

2.5 三萜酸热回流提取及其分离纯化 称取药材粉末5.0 g，按料液比1︰20 加入78%乙醇，90 ℃下加热搅拌，回流提取81 min，提取物4 700 r／min 离心10 min，抽滤，重复3 次，合并滤液，按“2.1”项下方法测定。浓缩后，依次用氯仿、饱和NaHCO3溶液萃取得三萜酸［10］。

2.6 三萜酸的声辅助提取及其分离纯化 称取药材粉末5.0 g，加入100 mL 90% 乙醇，超声提取2 次。每次40 min，超声功率400 W，提取物4 700 r／min 离心10 min，抽滤，重复3 次，合并滤液，按“2.1”项下方法测定。浓缩后，依次用氯仿、饱和NaHCO3溶液萃取得三萜酸［11］。

3 结果

3.1 单因素试验

3.1.1 固相碱类型 樟芝三萜在25 位碳上大多链接羧基基团，显酸性，在高能机械力作用下可能与固相碱反应生成水溶性物质，由于NaOH 碱性太强，会破坏三萜结构，故选择Na2CO3、NaHCO3，同时与硅胶进行比较，结果见图1。由图可知，与NaHCO3球磨时三萜酸得率明显高于与Na2CO3球磨时，其可能原因是Na2CO3碱性比较强，在机械化学反应中可使三萜结构破损；NaHCO3碱性相对较弱，对保持其结构的完整性更加有利，故选择NaHCO3作为固相碱。

图1 固相碱类型对三萜酸得率的影响

3.1.2 助磨剂用量 图2 显示，当NaHCO3用量由0 增加到10%时，三萜酸得率明显升高，而继续增加时其得率先降低后升高，并且趋势较平缓，故选择10% 作为助磨剂用量。

图2 助磨剂用量对三萜酸得率的影响

3.1.3 球磨时间 图3 显示，三萜酸得率随着球磨时间延长呈先增后减的趋势，在20 min 时最大，这可能是由于球磨时间过长会造成罐体温度升高，从而化合物结构被破坏，故选择20 min 作为球磨时间。

图3 球磨时间对三萜酸得率的影响

3.1.4 球磨转速 图4 显示，三萜酸得率随着转速增加呈先增后减的趋势，在300 r／min 时最大，这可能是因为随着球磨转数增大，供能增加，有利于细胞壁破碎释放有效成分，粉末粒度减小，得率提高；但转速过高时，机械强度增大，产生过多能量，致使体系温度升高，破坏有效成分，得率反而降低，故选择300 r／min 作为球磨转速。

3.2 Box-Behnken 响应面分析 结果见表2。然后，以三萜酸得率为评价指标（Y），进行17 个试验点（5 个中心点）的响应面分析，通过Design Expert 8.0.6 软件进行拟合，得回归方程为Y=0.381 79+6.489 17 ×10-3A+0.039 264B+0.088 830C-1.039 33×10-5A2-8.598 40×10-4B2-3.364 00×10-3C2。

图4 球磨转速对三萜酸得率的影响

表2 试验设计及结果

方差分析见表3。由表可知，模型F值高度显著（11.66），拟合度较好；失拟项P＞0.05，表明方程不失拟，能充分反映实际情况。综合分析，各因素对三萜酸得率的影响程度依次为球磨转速＞球磨时间＞助磨剂用量。

表3 方差分析

响应面分析见图5。在此基础上结合回归方程可知，最优提取工艺为球磨转速312.30 r／min，球磨时间22.83 min，助磨剂用量13.20%。考虑到实际操作情况，将其修正为球磨转速312 r／min，球磨时间23 min，球磨剂用量13.20%，三萜酸得率为0.239%。

图5 各因素响应面图

为了验证回归模型的可靠性，按照优化工艺进行3 批验证试验。结果，三萜酸得率为0.238%，与预测值（0.239%）相当，表明工艺稳定可行。

3.3 提取方法比较 表4 显示，机械化学提取时三萜酸得率明显高于乙醇回流提取和超声提取，而且时间更短，温度更低，表明其提取效果更优。

表4 3 种提取方法比较

4 讨论与结论

本实验通过Box-Behnken 响应面法，得到樟芝三萜酸最优机械化学提取工艺为球磨转速312 r／min，球磨时间23 min，固相碱（NaHCO3）用量13.20%，以水为提取溶剂，按1∶30 料液比在50 ℃下机械搅拌提取30 min，抽滤得提取液，加入4 倍量95% 乙醇，静置沉淀24 h 后，4 700 r／min离心10 min，上清液调pH 至2～3，氯仿萃取，即得，三萜酸得率为0.238%。与乙醇热回流提取法、超声辅助提取法比较，机械球磨提取不仅可提高三萜酸得率，还可缩减时间，提高效率，同时提取溶剂用水代替了乙醇，减少了有机试剂用量，更加绿色环保，从而使樟芝更好地发挥抗癌、保肝、抗炎等药理作用。