吴茱萸不同入药形式的成分差异

李 斐，董嘉皓，魏飞亭，乔日发，陈海芳，杨武亮，杨 明，袁金斌

（江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室，江西 南昌 330004）

中药的入药形式多种多样，有的以粉末直接入药，如散剂、丸剂；有的以提取物的形式入药［1-3］。入药形式不同，所含化学成分会有差异，药物功效也存在区别，不同入药形式对中药药效或毒性的影响可通过化学成分含有量的变化来分析。

吴茱萸为吴茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang 或疏毛吴茱萸Euodia ru-taecarpa（Juss.）Benth.var.bodinieri（Dode）Huang的干燥近成熟果实，性热，味辛、苦；有小毒［4］。临床上，吴茱萸的入药形式主要有2 种，为粉末入药，如戊己丸；为水煎剂，如复方吴茱萸汤、左金方。中医的遣方用药有其科学内涵，揭示吴茱萸在不同方药中的用药特点，弄清楚不同入药形式中化学组分含有量的差异是其基础和前提。

吴茱萸主要含生物碱、黄酮、柠檬苦素、酚酸、挥发油等［4-6］，已有的研究主要集中在生物碱和柠檬苦素类［4-5，7-8］，较少涉及黄酮、酚酸类［9-11］。根据文献［9-11］和前期研究［12-14］，课题组选取了9个代表性化合物作为含有量测定指标，分析吴茱萸不同入药形式中化学成分的差异。本研究充分优化了UPLC 条件，建立了吴茱萸2 种提取物中多成分含有量的同时测定方法，以期为该药材用药特点、药效物质基础和质量评价研究提供依据。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；电热套（北京科伟永兴仪器有限公司）；AE240 电子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；PS-80 A 超声波清洗机（东莞市洁康超声波设备有限公司）；L-500 型离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；116B 型高速中药粉碎机（瑞安市永历制药机械有限公司）。

新绿原酸（批号CFN97472）、隐绿原酸（批号CFN99117）对照品购自武汉天然植物生物技术有限公司；绿原酸、吴茱萸碱、吴茱萸次碱对照品购自中国食品药品检定研究院，批号分别为110753-200413、110802-200504、0801-9702；芦丁、金丝桃苷对照品购自成都曼思特生物科技有限公司，批号分别为16122011、16 102605；去氢吴茱萸碱（批号P24M7F11741）对照品购自上海源叶生物科技有限公司；吴茱萸新碱（批号15266-38-3）对照品购自上海胤珂生物科技有限公司，以上对照品质量分数≥98%。乙腈和甲醇（色谱纯，德国Merck 公司）；其他试剂均为分析纯。

药材均为课题组实地采集，信息见表1，标本保存于江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、金丝桃苷、去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱对照品适量，置于10 mL 量瓶中，无水甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得单一成分贮备液。分别精密吸取上述9 个贮备液1 mL 加入10 mL 量瓶中，无水甲醇定容至刻度，摇匀，得质量浓度分别为0.228、0.506、0.198、0.021、0.126、0.252、0.501、0.252、0.511 mg／mL 的对照品溶液。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2.1.2 供试品溶液

2.1.2.1 吴茱萸醇提液［12］药材放入60 ℃烘箱中烘2 h，粉碎，取粉末约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70%乙醇25 mL，称定质量，浸泡1 h 后超声40 min，放冷，再称定质量，70%乙醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.1.2.2 吴茱萸水煎液 取上述药材粉末约0.3 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入双蒸水25 mL，称定质量，浸泡1 h 后加热回流40 min，放冷，再称定质量，双蒸水补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.2 色谱条件 Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相0.1%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～3 min，4%～5% B；3～9 min，5%～6% B；9～12 min，6%～8%B；12～15 min，8%～20%B；15～20 min，20%～35% B；20～27 min，35%～80% B；27～35 min，80%～100%B；35～40 min，100%B）；体积流量0.3 mL／min；柱温30 ℃；检测波长326 nm；进样量1 μL。在该色谱条件下，各目标化合物获得了较好的分离，见图1。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 依次稀释上述对照品溶液，在“2.2”项条件下进样测定。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，以信噪比（S／N）分别为10 和3 时的质量浓度为定量限和检测限。结果见表2。

2.3.2 精密度试验 分别吸取水煎液、醇提液，在“2.2”项条件下进样测定，测得水煎液中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、金丝桃苷、去氢吴茱萸碱峰面积 RSD 分别为1.2%、0.4%、0.8%、1.8%、0.9%、0.5%，醇提液中分别为0.9%、0.6%、0.7%、0.9%、0.6%、0.7%、0.6%、0.5%、0.8%，表明仪器精密度良好。

图1 各成分UPLC 色谱图Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分线性关系、检出限、定量限Tab.2 Linear relationships，detection limits and quantitative limits of various constituents

2.3.3 稳定性试验 取药材粉末，按“2.1.2”项下方法制备2 种供试品溶液，室温下静置0、2、4、6、12、24 h 后在“2.2”项条件下进样测定，测得煎液中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、金丝桃苷、去氢吴茱萸碱峰面积RSD 分别为1.8%、0.5%、2.4%、1.7%、0.9%、0.5%，醇提液中分别为1.7%、1.5%、1.9%、1.4%、1.0%、1.1%、0.8%、1.0%、1.1%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批药材12 份，按“2.1.2”项下方法制备2 种供试品溶液，在“2.2”项条件下进样测定，测得水煎液中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、金丝桃苷、去氢吴茱萸碱峰面积RSD 分别为2.4%、0.6%、2.2%、1.6%、2.0%、0.4%，醇提液中分别为2.2%、1.7%、2.3%、2.1%、1.3%、1.0%、1.1%、1.6%、1.3%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 称取含有量已知的药材12 份，分成2 组，分别精密加入相当于样品指标成分量100% 的9 种成分对照品贮备液，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，计算回收率。结果，水煎液中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、金丝桃苷、去氢吴茱萸碱平均加样回收率分别为100.4%、98.8%、100.3%、99.9%、100.6%、99.2%，RSD 分别为1.2%、1.1%、1.4%、0.6%、1.6%、2.0%；醇提液中平均加样回收率为99.7%、102%、101.2%、99.3%、101.2%、98.4%、98.7%、100.9%、101.1%，RSD 分别为2.9%、2.7%、2.7%、1.4%、2.7%、2.4%、2.0%、2.5%、2.1%。

2.4 不同入药形式的影响

2.4.1 入药形式选择 吴茱萸的传统用药方式为水煎液和粉末，前者一直作为中药的传统入药形式，可提取到相对有效的化学成分，有一定的合理性。吴茱萸70%乙醇提取液保留了其绝大多数化学成分，2015 年版《中国药典》也以其为提取溶剂，故粉末可用70%乙醇提取液代替。

2.4.2 成分组成 课题组挑选了10 批药材，涵盖了三大品种、主要产区、不同年份。图1 表明，醇提物中的成分较多，包括酚酸、黄酮、柠檬苦素、吲哚类生物碱和喹诺酮类生物碱；水煎液中的成分则集中在色谱图的前半部分，大多为水溶性成分（如酚酸、黄酮、吲哚类生物碱），几乎不含极性较弱的喹诺酮类生物碱。

2.4.3 含有量测定 由表3 可知，绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸含有量以樟树丰溪产最高，去氢吴茱萸碱含有量以贵州凯里产最高，吴茱萸碱、吴茱萸次碱含有量以湖南黔阳产最高，吴茱萸新碱含有量以江西新干产最高。

另外，醇提液（对应于粉末入药形式）中各化合物含有量都不低，表明70%乙醇对吴茱萸各组分有较高的提取效率；水煎液中含有量显著低于醇提物中，以吴茱萸新碱为代表的喹诺酮类生物碱均未检测到。值得注意的是，水煎液中隐绿原酸含有量显著高于醇提物中（超出平均值1.6 倍），2号色谱峰（绿原酸）前的1 个色谱峰平均峰面积之比（水煎液／醇提液）也是1.6，见图1。

表3 各成分含有量测定结果（%， n=3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（%， n=3）

3 讨论与结论

王智民［5］曾指出生物碱在水煎剂中的转移率很低，而其水溶性比较大的成分（如去氢吴茱萸碱、黄酮、绿原酸等）则相对较高，这些成分与吴茱萸的药理活性是否有关还有待深入研究。由于绿原酸不稳定，通过同时测定其3 种同分异构体含有量更能准确可靠地评价酚酸类成分在醇提液和水煎液中的差异，因此本研究系统报道了吴茱萸中绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸含有量的同时测定。为比较吴茱萸2 种入药形式对其组分的影响，本实验选取了9 个代表性化合物，可较好地反映其整体变化。

吴茱萸在临床应用上主要用于镇痛、止呕，文献表明其醇提液的镇痛效果更好［8，15］，药效可能与部分生物碱类成分相关；水煎液的止呕作用更明显，活性物质大多为水溶性成分［13］。血清药理学研究发现，除酚酸类及黄酮类外，生物碱类的代谢产物也较多，表明吴茱萸药理作用可能是多个成分共同作用的结果［16］。由于粉末中成分类型较全，含有量较高，故从药效（特别是镇痛作用）方面而言，它可能是一种较好的入药形式。

历代本草均记载吴茱萸有小毒，现代研究表明其毒性程度依次为挥发油＞醇提物＞水提物［14，17-19］。吴茱萸的肝毒性可能与极性较弱的生物碱，尤其是喹诺酮类生物碱有关［14，19］，而它在水煎液中的转移率极低，因此从用药的安全性来说，水煎剂是一种比较合适的用药形式。

中医的遣方用药有其科学内涵，综合考虑了药物功效、毒性、安全，反映了对药物活性组分的取舍。于吴茱萸而言，有时候主要利用其镇痛功效，有时候侧重其止呕效果，有时候需长期用药而必须考虑其安全性，这时候用药形式也应加以考虑，如镇痛施丸剂（粉末），止呕用汤剂（水煎）。