显微介导河蟹基因的镜鲤F1代肌肉营养成分分析

闫学春，栾培贤，何立川

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室，淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150070）

中华绒螯蟹Eriocheir sinensis（也称河蟹）是我国特有的大型淡水蟹类，自然分布较广，肉质细嫩，味道鲜美，含有丰富维生素和矿物质，蛋白质的含量要高于鱼肉和猪肉的几倍，具有优良的遗传资源[1，2]。德国镜鲤Cyprinus carpio L.是我国主要的淡水养殖鱼类，应用外源总DNA 直接导入法，将河蟹的这些有益的特定营养成分导入镜鲤，对加速优质镜鲤品种的选育，培育出适合消费需求的多样化优质镜鲤养殖新品种具有重要意义[3]。对显微介导河蟹总DNA 导入镜鲤的检测与分析已有报道[2]。显微介导远缘杂交技术可以进行常规育种方法难以完成的品种间，甚至更远的品种间的杂交，实现目的基因转移。

近年来，随着人们生活水平的不断提高，对淡水鲤科鱼类肉质的要求也在提高。提高低质淡水鲤科鱼类品质是我国水产育种工作重要任务。而肌肉营养组成是评定鱼类经济价值的重要指标和了解其肉质的最直接方法。利用外源总DNA 导入技术来提高动植物及其子代的氨基酸和蛋白等含量的研究已有过报道。如徐德昌等将大豆Glycine max（Linn.）Merr.基因组DNA 导入春小麦Triticum aestivum L.，获得了蛋白含量高2 个百分点，清蛋白、球蛋白含量也明显提高的一批可遗传的变异株[4]；毛万霞等利用花粉管通道法和两种不同压力基因枪法将大豆总DNA 导入大麦Hordeum vulgare L.，大麦后代籽粒的蛋白质和必需氨基酸含量都有提高[5]；吕英海等采用基因枪法和花粉管通道法将大豆总DNA 直接导入大麦，提高了籽粒总氨基酸和各种必需氨基酸含量[6]；闫学春等利用显微介导远缘杂交技术，将中国明对虾Fenneropenaeus chinensis 总DNA 导入鲤受精卵内，提高了显微介导中国明对虾基因的鲤及其子代的蛋白质和氨基酸含量[7,8]。本文通过分析显微介导河蟹基因的镜鲤与普通镜鲤肌肉的营养成分，研究和比较这两种镜鲤的营养价值，发现显微介导河蟹基因镜鲤的蛋白和氨基酸含量高于普通镜鲤，为超远缘分子杂交和创制镜鲤新种质技术提供了新方法和新途径。

1 材料和方法

1.1 材料

显微介导河蟹基因的镜鲤取自本课题组生产的1 龄显微介导河蟹基因镜鲤F1代（以下简称实验鱼）和普通镜鲤（以下简称对照鱼），各随机取30尾，平均体质量分别为234g 和227g。2 种鱼的生长环境、饲养管理、饲料投喂等均相同。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

肌肉样品采用冷鲜样品。取实验鱼与对照鱼背部肌肉，去皮，将鱼肉切成小块、捣碎，用于测定蛋白质和氨基酸含量。

1.2.2 常规营养成分测定

粗蛋白和氨基酸含量由农业部谷物及制品质量监督检验测试中心（哈尔滨）测定。粗蛋白质测定采用凯氏微量定氮法（国家标准：GB 5009.5-2010）；17 种氨基酸含量用盐酸水解法（国家标准：GB/T 5009.124-2003），经日立L-8800 型氨基酸自动分析仪测定。色氨酸在水解过程中被破坏没有测定。

1.3 营养评价

实验鱼的营养价值评价依据FAO/WHO 1973年建议的每克氮氨基酸评分标准模式和鸡蛋蛋白模式进行比较。氨基酸评分（Amino Acid Score,AAS）、化学评分（Chemical Score,CS）和必需氨基酸指数（Essential Amino Acid Index,EAAI）分别按下式计算[9-12]。

式中，n 代表比较的氨基酸数；tn代表实验蛋白质的氨基酸；sn代表鸡蛋蛋白质的氨基酸。

1.4 数据处理

结果以平均值±标准差（x±s）表示，采用SPSS软件进行统计分析，用t 检验法分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 一般营养成分

经测定，显微介导河蟹基因的镜鲤肌肉中粗蛋白质含量为20.71%，比普通镜鲤（18.32%）高13.05%，数理统计分析表明，没有显著差异（P＞0.061）（图1）。

图1 显微介导河蟹基因的镜鲤F1代与普通镜鲤的蛋白质含量Fig.1 The contents of protein in F1generation of mirror carp with micro-injection Chinese mitten handed crab and common mirror carp

2.2 氨基酸组成

由表1 可知，显微介导河蟹基因的镜鲤与普通镜鲤均含有17 种氨基酸，含量分别为78.94%和67.89%。两种鱼的谷氨酸、天门冬氨酸、甘氨酸和丙氨酸4 种鲜味氨基酸总量[13,14]分别为30.12%和25.86%，显微介导河蟹基因的镜鲤总氨基酸含量和4 种鲜味氨基酸含量均高于普通镜鲤。

图2 F1代显微介导河蟹基因镜鲤的鲜味氨基酸含量Fig.2 The content of flavor amino acids in F1mirror carp generation with micro-injection Chinese mitten handed crab gene

由表2 可知，显微介导河蟹基因的镜鲤与普通镜鲤中均含有7 种人体必需氨基酸（苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和赖氨酸），其含量分别占氨基酸总量的40.82%和41.02%，显微介导河蟹基因的镜鲤必需氨基酸总含量比普通镜鲤高15.69%。

2.3 氨基酸营养评价

表2 和表3 是分别将显微介导河蟹基因的镜鲤和普通镜鲤肌肉蛋白中氨基酸含量换算成每克氮中含氨基酸毫克数，再与蛋白质评价的氨基酸标准模式和鸡蛋蛋白质的氨基酸模式进行比较，计算出两种鱼的氨基酸评分（AAS）、化学评分（CS）和必需氨基酸指数（EAAI）。

3 讨论

3.1 显微介导河蟹基因的镜鲤和普通镜鲤肌肉常规营养成分比较

蛋白质含量是鱼类营养价值的体现，是评价和建立鱼类种质标准的重要指标之一[15-19]。而导入单个基因对鱼类蛋白的影响已在唐鱼Tanichthys albonubes 和鲤进行研究。如樊佳佳和白俊杰在分析含有外源基因的转红色荧光蛋白基因唐鱼的肌肉营养成分时，发现转基因唐鱼的粗蛋白质含量高于非转基因唐鱼，但差异不显著（P＞0.05）[20]；闫学春等[21]发现，转大麻哈鱼Oncorhynchus keta 生长激素基因的鲤肌肉中蛋白质含量稍高于非转基因鲤，但无显著差别（P＞0.05）；崔宗斌等[22]发现，转人Homo sapiens 生长激素基因F2代阳性红鲤的蛋白质含量显著高于对照鱼。在本研究中，显微介导河蟹基因的镜鲤肌肉中粗蛋白质含量为20.71%，比普通镜鲤（18.32%）高13.05%，其原因可能是导入的外源基因是控制蟹类蛋白质合成的某段基因，激活了镜鲤的一些相关基因，导致显微介导河蟹基因的镜鲤蛋白质含量增高。至于是导入经过遗传修饰的单个基因，还是未经遗传修饰的外源总DNA 的导入会影响鱼体内蛋白质合成与分解的代谢机制，还有待进一步深入研究。目前，已报道，有多个信号通路参与了蛋白质的合成与分解代谢过程。如泛素-蛋白酶体通路（ubiquitin-proteasome pathway,UPP）是调节细胞内蛋白水平与功能的重要机制，是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内绝大多数蛋白质的降解[23-25]；而雷帕霉素靶蛋白（Target of Rapamycin,TOR）信号通路是控制蛋白质合成的主要通路，TOR调控整体的翻译水平，促进细胞生长[26-28]。从本研究结果看，可能是导入的河蟹基因直接参与了这些信号通路，也有可能是间接调控这些通路中的关键酶，从而影响了显微介导河蟹基因的镜鲤的蛋白质组成，进而促进了蛋白质含量的提高，当然，影响显微介导河蟹基因的镜鲤更为精细和复杂的代谢变化，值得继续深入研究。

表1 显微介导河蟹基因的镜鲤F1代与普通镜鲤的肌肉中氨基酸含量（g/100g DW）Tab.1 The contents（g/100g DW）of amino acids in muscle of mirror carp F1generation with micro-injection Chinese mitten handed crab gene and common mirror carp

表2 F1代显微介导河蟹基因的镜鲤与普通镜鲤肌肉必需氨基酸含量Tab.2 The contents of essential amino acids in muscles of F1generation of mirror carp with micro-injection Chinese mitten handed crab gene and common carp

表3 F1代显微介导河蟹基因镜鲤与普通镜鲤的氨基酸评分、化学评分和必需氨基酸指数比较Tab.3 Comparison of amino acid score,chemical score and essential amino acid index in mirror carp with microinjection Chinese mitten handed crab gene and common carp

3.2 显微介导河蟹基因的镜鲤氨基酸含量分析和营养价值评定

分析结果表明，显微介导河蟹基因的镜鲤与普通镜鲤均含有17 种氨基酸（色氨酸除外），第一限制氨基酸都是缬氨酸，不同的是：显微介导河蟹基因镜鲤的第二限制氨基酸是苏氨酸，而普通镜鲤是蛋氨酸和胱氨酸。这与显微介导中国对虾基因的鲤的研究结果一致[7，8]。而第一限制氨基酸缬氨酸在显微介导河蟹基因的镜鲤中含量要高于普通镜鲤，且差异显著，可以在蛋白质营养上起到补缺作用。显微介导河蟹基因镜鲤的必需氨基酸占总氨基酸的40.82%，高于WHO/FAO 模式，低于鸡蛋蛋白模式，而普通镜鲤都低于这两种模式。显微介导河蟹基因的镜鲤与普通镜鲤肌肉的必需氨基酸指数分别为72.92 和62.68，其营养价值高于普通鲤。由表1 可知，天门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸这4 种鲜味氨基酸在显微介导河蟹基因的镜鲤肌肉中含量较高，达30.12%，比普通镜鲤（25.86%）高，其中甘氨酸和丙氨酸差异显著，其味道要比普通镜鲤更鲜美。4 种鲜味氨基酸含量随导入河蟹总DNA 的显微介导河蟹基因镜鲤总氨基酸含量的提高而升高，而其他必需氨基酸也会明显提高，如苏氨酸、缬氨酸，与普通镜鲤比较，差异显著。这表明利用显微介导远缘杂交技术导入河蟹总DNA 还能够全面提高镜鲤的蛋白质质量，这对镜鲤的品质改良具有重要意义。

综上所述，显微介导河蟹基因的镜鲤与普通镜鲤肌肉营养成分的构成种类一致，但是，含量上差异很大，特别是氨基酸含量。显微介导河蟹基因的镜鲤肌肉营养成分高于普通镜鲤，暗示了河蟹基因对显微介导河蟹基因镜鲤的蛋白质合成与分解代谢产生了不可忽略的影响。通过显微介导远缘杂交技术导入外源总DNA，可以进行常规育种难以做到的种间杂交，实现优良性状基因的转移，弥补了优异基因资源的缺乏，特别是与鱼肌肉品质相关的基因，本技术为解决在远缘甚至超远缘物种间多基因复杂性状的转移提供了很好的思路和方法。