达里湖鲫和人工选育红鲫杂交子代对NaHCO3碱度的耐受力

常玉梅，孙博，张立民，梁利群

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，中国水产科学研究院特殊生境鱼类种质特性与抗逆育种重点实验室，农业农村部淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室，淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室，黑龙江 哈尔滨 150070）

我国北方地区有很多水质理化因子特殊的盐碱水域，如盐碱湖泊、地下咸水和盐碱化沼泽等，尚未得到有效开发利用。实践证明，“以渔治碱”是开发利用盐碱水域的有效途径之一[1]。筛选培育耐盐碱、生长快、抗病力强的鱼类新品种或杂交种，对改善盐碱水域生态环境，拓宽宜渔水面，发展节水养殖具有重要的战略意义。

杂交育种是水产生物育种的重要途径之一。目前，在全国范围内广泛开展的鱼类品种间杂交选育，尤以鲤Cyprinus carpio 品种间的杂交效果最好[2]。迄今，已获得诸如丰鲤（C.carpio var.Xingguo♀×C.carpio var.mirror splittered ♂）、荷元鲤（C.carpio var.Wuyuanensis ♀× C.carpio Yuanjiang♂）、建鲤（C.carpio var.Jian）、荷包红鲤抗寒品系（C.carpio var.Wuyuanensis）、松浦鲤（C.carpio var.Songpu）等十几个具有明显杂种优势的杂交种[2,3]。鲫Carassius auratus 是我国大宗淡水主要养殖种之一，具有适应性强、性成熟周期短、养殖成本低等特点，是良好的育种材料。目前培育出的鲫品种有异育银鲫中科三号C.gibelio[4]、异育银鲫C.gibelio[5]、湘云鲫（triploid crucian carp,crucian carp ♀× allotetraploid carp♂）[6]、高邮鲫（C.auratus auratus ♀×C.auratus Cuvieri ♂）[7]和蓝花长尾鲫（goldfish ♀×red crucian carp ♂）[2]等。

达里湖鲫C.auratus 生活在内蒙古高盐碱湖泊—达里湖，常年耐受碱度53.57 mmol/L、pH 高达9.69 的恶劣水域中，成为该湖除瓦氏雅罗鱼Leuciscus waleckii 外的另一主要经济鱼类。但是，达里湖鲫的生长速度一般比同龄淡水鲫慢1～2 年[7]。虽然盐碱鲫和淡水鲫的表型差异较小，但二者的基因组组成和结构已开始分化。笔者利用微卫星分子标记（SSR）分析达里湖鲫和黑龙江双凤水库鲫C.auratus 的基因型，发现二者基因组遗传分歧较大（常玉梅等，待发表）。该研究结果与池炳杰等[9]分析盐碱瓦氏雅罗鱼和淡水瓦氏雅罗鱼的遗传差异的结果一致。因此，盐碱鲫和淡水鲫杂交获得的杂交种极有可能产生杂种优势。本课题组以达里湖鲫为选育主体开展了鲫种内和种间杂交，发现种内正反交的F1杂种优势明显，达里湖鲫的耐盐碱特性在杂交F1中均得到了保持，平均耐受能力也显著高于其他常规主养鱼类，同时具有一定的生长优势[10]。

本研究通过测定达里湖鲫杂交子代的生长、潜在免疫力及耐高碱等性状的相关指标，并采用单因素变量、主成分以及多因素线性回归等统计方法进行了分析，以期为科学评估杂交鲫的综合生产性能及良种申报提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验用达里湖鲫自交F1（J，母本）和黑龙江水产研究所人工选育红鲫（H，父本）的杂交子一代（JH，F1）约2 000 尾，在中国水产科学研究院黑龙江水产研究所呼兰实验站室外土池饲养122d，随机挑选180 尾，平均体质量约90g 的杂交F1运回实验室进行后续实验。

1.2 生长和免疫指标测定

暂养2d 后（换水、不投饲），测定每个个体的体质量（BW），然后从尾静脉抽取约0.5mL 的血液（无抗凝剂），为了明确每个检测指标的对应关系，将所有180 尾个体进行剪鳍标记等量分配到6 个大小相同、循环、温控的水族箱内（96.5cm×52.5cm×45.5cm）继续暂养，用于后续的耐高碱实验。血液样本4℃静置过夜后，3 500r/min 离心10min 获取血清，根据南京建成科技有限公司生产的试剂盒说明书，采用酶标仪（Bio-Teck）分别测定血清中的丙二醛（MDA）含量、碱性磷酸酶（AKP）、总超氧化物歧化酶（TSOD）及过氧化氢酶（CAT）的活性。

1.3 耐高碱性状测定

前期抽血测定免疫指标对鱼体造成了一定损伤，为了规避后续实验误差，所有实验鱼在6 个上述水族箱内继续暂养40d，其中每2 个水族箱共享一个循环槽，保证实验有三组平行，每个平行有2个重复。在体能恢复期间，水质为曝气的自来水，每天换水1/3，饲喂2 次，水温17～18℃、溶解氧7.24～8.21mg/L、pH7.29～7.44、盐度0.11～0.17mg/L、碱度0.44～0.48 mmol/L。

盐碱湖泊生存的鱼类通常能够耐受较高的氨氮含量[11]。因此，本研究以成活和死亡个体血液的氨氮含量作为衡量其耐碱性状的生理指标。具体实验步骤如下：实验鱼饥饿48h 后，以20mmol/L/d 为梯度，将NaHCO3等量地添加到每个水族箱内，至第6d 增至120mmol/L；根据预实验结果，第7d 增加10mmol/L 至130 mmol/L（pH9.2～9.3），实验鱼开始出现死亡。维持该碱度，以96h 累计死亡率超过50%为基准，后续成活个体视为耐碱个体。分别抽取濒死个体和成活个体少量血液，利用南京建成科技有限公司生产的试剂盒，测定血氨（Ammonia-N）和尿素氮（Urea-N）含量。实验期间不投饲，全程采用YSI水质分析仪监测水中的溶氧、盐度、pH 和氨氮等参数。

1.4 数据统计与分析

采用SAS 9.4 软件统计分析所测得的生长、潜在免疫力和耐高碱性状数据。首先对三组性状指标进行Pearson 相关性分析，然后分析高碱胁迫下杂交F1的成活和死亡个体三组性状所有指标的差异性，对影响耐盐碱存活的多个因素进行主成分分析和多因素Logistic 线性回归分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。由于Logistic 分析不能对数据采集不完整的个体和极端值进行分析，因此在数据分析中剔除了数据缺失和极端数值，用于最后数据分析的有效个体为131 尾。

2 结果与分析

2.1 表型和血液生理指标的相关性分析

采用Pearson 关联分析对杂交F1的7 个指标进行相关性分析。结果如表1 所示，BW 与MDA（r=0.195）和TSOD（r=0.245），MDA与TSOD（r=0.237）、Ammonia-N（r=0.311）和Urea-N（r=0.199），以 及Ammonia-N 和Urea-N（r=0.668）之间均呈显著正相关（P＜0.05）；AKP 与Ammonia-N（r=-0.262）和Urea-N（r=-0.173）、TSOD 和CAT（r=-0.355）则呈显著负相关（P＜0.05）。

2.2 存活与死亡个体表型和血液生理指标的单因素变量分析

表1 杂交子鲫代（F1）7 个表型和血液生理指标的相关系数（N=131）Tab.1 Pearson’s correlation coefficients among seven traits（N=131）in the hybrid crucian carp

表2 杂交F1存活和死亡个体表型和血液生理指标的差异（平均值±标准差）Tab.2 Differences of growth and blood physiological indices between the survivor and the death in the hybrid crucian carp（mean ± sd）

如表2 所示，高碱胁迫下F1存活和死亡个体除平均BW 和CAT 活性之间无显著差异外，二者的其它指标均存在显著差异（P＜0.05）。其中存活个体的AKP 平均活性显著高于死亡个体，而MDA、Ammonia-N 和Urea-N 的平均含量及TSOD 活性显著低于死亡个体（P＜0.05）。

2.3 存活与死亡个体表型和血液生理指标的主成分分析

变量BW 和CAT 不符合Kaiser-Meyer-Olkin（KMO）（KMO＜0.5）标准[12]，只对其他5 个变量MDA、AKP、TSOD、Ammonia-N 和Urea-N 进行主成分分析（PCA）。由表3 可知，前3 个主成分的特征值均大于1，方差贡献率分别为39.0%、22.3%和20.1%，累计贡献率为81.4%，第一主成分贡献率明显大于其他主成分贡献率。进一步权重系数分析显示，第一主成分起主要作用的是MDA、Ammonia-N 和Urea-N，均具有正向的载荷值，分别为0.513、0.883 和0.808，解释了变异的43.3%；第二主成分起主要作用的是MDA 和TSOD，也具有正向的载荷值，分别为0.626 和0.691，解释变异的32.1%；第三主成分起主要作用的为AKP 和TSOD，具有正向载荷值0.751和负向载荷值-0.525，解释变异的24.6%（表4）。

2.4 存活与死亡个体多因素logistic 线性回归分析

为利用现有性状数据建立预测鲫杂交后代耐受NaHCO3碱度存活特性的多因素线性回归模型，以存活和死亡作为因变量，将具有统计学差异的各项单因素和主成分中对模型贡献率大的因子纳入多因素Logistic 模型分析。由表5 可知，AKP、MDA、Ammonia-N 和Urea-N 以及MDA×Urea-N 和Ammonia-N×Urea-N 等多个因子及因子相互作用对杂交个体耐受性存在显著影响（P＜0.05），其中MDA、Ammonia-N 和Urea-N 预测的系数为负值，说明这3 个参数对鲫杂交子代耐受性是负调控。AKP、MDA×Urea-N 之间的互作、Ammonia-N×Urea-N之间的互作正面影响杂交F1的存活。AKP 酶活性变化影响鲫耐受的存活概率，存活个体是死亡个体几率的1.758 倍；其他变量，如MDA×Urea-N 及Ammonia-N×Urea-N 相互作用的比率比接近1，和其他较小比率比的变量，如与Urea-N 相比，这些变量增加了耐受个体存活的概率。多因素Logistic 模型拟合度预测分析显示，利用此模型预测50%个体存活的假阳性7.4%，假阴性11.7%，正确率90.1%，敏感度84.7%和特异性94.4%（表5）。

表4 主成分的权重系数Tab.4 Weight coefficient of principal components

表5 杂交子鲫代（F1）存活和死亡个体多因素Logistic 分析Tab.5 Multifactor logistic analysis between the survivor and the death in the hybrid crucian carp

3 讨论

3.1 鲫杂交F1综合生产性能评价

杂交是传统育种手段之一，旨在通过动植物属间、种间、种群间的个体的交配，谋求杂种优势（heterosis 或hybrid vigor），获得在生长性能、繁殖力、适应力、抗病性、肉质等方面超越双亲或兼具双亲某些特点的杂种。杂种优势是生物界的普遍现象。如在农作物中，杂交玉米和杂交水稻均取得巨大成功，为中国乃至世界的粮食保障做出了巨大贡献；鱼类中也开展了杂交F1的制种工作并获得了可喜成就，如澳大利亚银鲈Bidyanus bidyanus 的种间杂交Murray River×Cataract Dam 获得的MC 杂交种具有显著的生长优势[13,14]；尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus × 萨罗罗非鱼Sarotherodon melanotheron有较高的耐盐性能[15]。

本团队前期经过连续两年的池塘生长对比实验发现，以达里湖鲫和人工选育红鲫制备的杂种F1优势相对稳定，这与两个亲本的种质相对比较“纯”有直接关系。达里湖鲫亲本是由野生亲本经人工驯养后构建的自交家系，红鲫则是人工选育品种。为了更好地度量杂交子代的生产性能，本研究测定了其生长、潜在免疫力以及耐高碱等性状的相关指标，并用单因素变量、主成分以及多因素线性回归等统计方法进行了深入剖析。

从7 个表型和血液生理指标的相关性分析（表1）可以看出，MDA 和Ammonia-N 及Urea-N 之间存在显著的正相关，而AKP 与Ammonia-N 及Urea-N之间存在显著的负相关。该结果与个体碱耐受能力测定结果相一致：耐碱存活个体的AKP 含量显著高于死亡个体，而MDA、Ammonia-N 及Urea-N 含量显著低于死亡个体；TSOD 与MDA 呈正相关，间接影响个体的碱耐受力，而BW 和CAT 活性则对子代耐碱能力强弱无明显影响。主成分分析提取到了3个主成分，累计贡献率高达81.4%，较好地反映了影响杂交鲫耐高碱的大部分信息，进一步验证了单因素相关性的分析结果。

多因素Logistic 模型预测分析表明：MDA、Ammonia-N 和Urea-N 对杂交子代的耐碱能力具有显著的负调控作用，而AKP 的正调控作用更明显，其在存活/死亡个体中的占比达到1.758∶1，远高于其他指标。进一步的预测能力检测显示，本研究采用的以50%存活或死亡为基准的判定方法的假阳性率低，正确率和特异性都在90%以上，表明此方法的可信度高。

综上，无论从单因素、主成分还是多因素线性回归分析来看，鲫杂交子代的生长与碱耐受力无显著关联，而潜在免疫力指标及氨氮含量与鱼类的耐碱能力相关性显著，MDA、Ammonia-N 和Urea-N 为负调控，AKP 为正调控。

3.2 耐盐碱鱼类血液生理适应性机制

排氨是鱼类必需的生理过程。环境中高pH 或高氨浓度使鱼体内正常的“血液-水”的NH3扩散梯度下降或逆转，血液和组织内氨大量积累，导致鱼类死亡[16]。但是，在许多高盐碱湖泊，仍有一些鱼类存活并繁衍生息。如肯尼亚马加迪湖（Lake Magadi,pH 10）的马加迪罗非鱼Oreochromis alacalicus grahami[17]、美国内华达州皮拉米德湖（Pyramid Lake,pH 9.4）的钩吻鳟Oncorhynchus clarki henshawi[18]、土耳其凡湖（Lake Van，pH 9.8）的卡拉白鱼Chalcalburnus tarichi[19]、我国青海湖（pH9.1～9.5）的裸鲤Gymnocypris przewalskii[20]和内蒙古达里湖（pH 9.6）的瓦氏雅罗鱼[21]等。

耐盐碱鱼类通常能够耐受较高的氨氮含量，如马加迪罗非鱼LC50的氨氮含量是其他常规硬骨鱼类的6 倍；卡拉白鱼血液氨氮含量高达1 300 μmol N/L，远高于虹鳟400μmol N/L[11]。这些耐盐碱鱼类是如何解决高盐碱环境下的排氨难题呢？据报道，耐盐碱鱼类具有特殊的氨氮排泄机制：一是血液中的高氨氮含量有助于“血液-水”的氨分压梯度（ΔPNH3），使鱼体内氨持续外泄[11]；二是将过多的氨氮转换成毒性较弱的游离氨基酸或尿素排出体外，如随着碱度的升高，达里湖瓦氏雅罗鱼血浆游离氨基酸含量显著增加，其中非必需氨基酸含量作为能量代谢底物增加更为明显[22]；三是氨氮排泄基因显著富集表达，如达里湖瓦氏雅罗鱼和鲤Cyprinus carpio 鳃组织中参与鱼体排氨过程的4 种Rh 基因（Rhag，Rhbg，Rhcg1 和Rhcg2），全部富集上调表达[23-25]。本研究中，高碱胁迫下存活个体的氨氮含量显著低于死亡个体（表2），即存活杂交个体获得了母本达里湖鲫的氨氮排泄策略（同瓦氏雅罗鱼），或将体内多余的氨氮转换为毒性较弱的尿素和游离氨基酸，或通过高表达排氨氮基因将体内的氮代谢废物排出体外，适应高碱环境。

AKP 是衡量机体免疫机能和健康状况的重要指标，可将代谢产物水解成磷酸和乙醇，然后将这些生成的小分子物质排出体外[26]。已有研究发现，青海湖裸鲤[27]、文昌鱼Branchiostoma lanceolatum[28,29]、中国明对虾Fenneropenaeus chinensis[30,31]、草鱼Ctenopharyngodon idellus[32]等受到盐碱、pH、化学药物及重金属等因子胁迫时，鱼体会提高AKP 酶活性以适应不良环境，这与本研究结果一致。由此可看出，AKP 可以作为鱼类盐碱耐受能力的一个重要预测指标，即AKP 活性高的个体，盐碱耐受力高，这可能是耐盐碱个体通过加强AKP 酶的去磷酸化反应，参与代谢产物的降解及调节Na+/K+-ATP 活性[33,34]，维持体内稳态适应高盐碱环境。