鲫Carassius auratus 基因组中多拷贝瘦素基因的克隆与序列分析

王乐，程磊

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070）

瘦素基因（Leptin，Lep）最初克隆于肥胖突变型小鼠，该基因的突变会导致小鼠过度肥胖[1]。大量研究表明，Lep 基因在脊椎动物脂肪沉积和能量代谢调控中发挥关键作用。鱼类的Lep 基因首先从红鳍东方鲀Takifugu rubripes 中克隆得到[2]。在重要模式生物斑马鱼Danio rerio 中鉴定到Lep 基因的两种亚型，被分别命名为Lepa 和Lepb[3]。迄今已有数十种鱼类的Lep 基因被陆续鉴定出来，分析显示真骨鱼类普遍存在两种Lep 基因亚型，支持真骨鱼类较四足动物多经历了一轮额外的全基因组加倍的观点[3]。

鲫Carassius auratus 是我国重要的养殖鱼类之一，2017 年我国的鲫养殖产量超过了280 万t。鲫在分类上属于鲤形目Cypriniformes 鲤科Cyprinidae 鲤亚科Cyprininae，与同属于鲤科的斑马鱼Danio rerio具有25 条染色体不同，鲤亚科鱼类通常有50 条染色体，推测鲤亚科在斑马鱼等真骨鱼类的基础上多经历了一轮基因组加倍[4]。Tang 等[5]在鲤Cyprinus carpio 中克隆到Lepa 和Lepb 基因，发现Lepa基因确实如预期一样在鲤基因组中存在进一步的加倍，可以分成Lepa1 和Lepa2。但是，该研究只报道了一种Lepb 基因。在Genbank 数据库中现在可以查询到若干鲫Lep 基因的同源序列，但是多不完整。尚不清楚鲤、鲫的基因组中是否如预期一样存在两份拷贝的Lepb 基因。

在上述工作的基础上，利用PCR 同源扩增的方法成功克隆了鲫Lep 基因的四个亚型，在鲤基因组中获得了Lepb 基因的两个亚型。这进一步验证了鲤、鲫等鲤亚科鱼类比斑马鱼等真骨鱼类多了一轮的基因组加倍，为全面研究鲤、鲫的Lep 基因的功能及不同亚型在功能和调控机制上的分化奠定了基础[4]。

1 材料与方法

1.1 材料

研究中所用的鲫Carassius auratus 和鲤Cyprinus carpio 采自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所呼兰实验站。剪取约200 mg 尾鳍，利用蛋白酶K 消化—酚氯仿抽提法纯化总DNA。获得的DNA沉淀重新溶解于去离子水中后，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度，以Nanodrop8000 检测DNA 的浓度和纯度后，调整到约50ng/μL 备用。

1.2 方法

1.2.1 Lep 基因克隆

克隆Lep 基因的PCR 引物来源于Tang 等[5]的报道及根据GenBank 数据库序列信息设计的新引物。引物的信息如表1 所示，克隆不同Lep 基因所需的具体引物对在结果部分分别叙述。PCR 反应体系为50μL，包含25 μL 的2×Es Taq MasterMix（Dye）（康维世纪）、10 μM 的上下游引物各2μL，1μL 的DNA 模板，用ddH2O 补足至50μL。PCR 扩增条件如下：94℃预变性2 min；35 个循环，每个循环94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸90s；72℃终延伸15min。所有PCR 扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，用Axygen 胶回收试剂盒纯化。纯化产物连接至pMD19-T 载体（TaKaRa），并转化至DH5α 感受态细胞（TaKaRa）中。挑选阳性克隆，委托金唯智生物科技有限公司用3730XL 毛细管电泳平台测序。

表1 本研究所用到的引物信息Tab.1 Primers used in the experiment

1.2.2 Lep 基因序列分析

测序结果使用BioEdit 7.0 软件拼接和整理，参考斑马鱼等已知鱼类的Lep 基因的注释信息，利用Expasy 的在线工具Translate（https://web.expasy.org/translate/）预测各Lep 基因的开放阅读框及氨基酸序列。注释后的鲤鲫Lep 基因序列被提交至Genbank 中（检索号分别MK482332-MK482337）。利用Expasy 的在线工具ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）计算预测各蛋白质的理论等电点（pI）和分子量信息；利用在线工具SignalP 4.0 预测信号肽序列及半胱氨酸残基（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）；利用含有SWISS-MODEL 的ProModII 程序分析蛋白质高级结构。利用cluster W软件将克隆得到的Lep 基因与从Genbank 中下载得到的硬骨鱼类及四足动物的Lep 基因的氨基酸序列一起进行多重比对，利用Mega3.1 软件提供的NJ（Neighbor-joining）法绘制Lep 基因的系统发育树。

2 结果与分析

2.1 鲫Lepa 基因的克隆及序列分析

利用表1 中的1、2 引物对扩增，可获得鲫Lepa1（CaLepa1）的基因全长序列，用3、4 引物对扩增可得鲫Lepa2（CaLepa2）的基因全长序列。CaLepa1基因CDS 全长719bp，其开放阅读框全长为516bp，由两段外显子组成，编码171 个氨基酸序列，非编码序列包括41bp 的5’-非编码区序列（5’-UTR）、89bp 的内含子序列及73bp 的3’-非编码区序列（3’-UTR）组成（图1A）。所编码的氨基酸序列包含20 个信号肽序列及2 个半胱氨酸残基。预测所得蛋白分子量为19.51 ku，理论pI 为8.96，不稳定系数为38.55，脂肪系数为116.32，亲水性系数为-0.049，表明其为亲水性蛋白。CaLepa2 全长745bp，其开放阅读序列为510bp，由两段外显子组成，可编码169个氨基酸序列，非编码序列包括50bp 的5’-UTR、102bp 的内含子序列及83 bp 的3’-UTR 组成（图1B）。所编码的氨基酸序列包含20 个信号肽序列及2 个半胱氨酸残基。预测所得蛋白分子量为19.10 ku，理论pI 为8.87，不稳定系数为35.15，脂肪系数为118.88，亲水性系数为0.041，表明其为疏水性蛋白。

2.2 鲫Lepb 基因的克隆及序列分析

利用表1 中的5、8 引物对扩增可获得鲫Lepb1（CaLepb1）的基因全长序列。而鲫Lepb2（CaLepb2）的基因全长序列则需要用4、7 及6、9 两对引物分别扩增、拼接而成。CaLepb1 的全长序列为1 476bp，其开放阅读序列为507bp，由两个外显子组成，编码168 个氨基酸，非编码序列由281bp 的5’-UTR、654 bp 的内含子序列及34 bp 的3’-UTR 组成（图1C）。CaLepb1 所编码的氨基酸序列包含16 个信号肽及3 个半胱氨酸残基，预测所得蛋白分子量为19.31ku，理论pI 为5.19，不稳定系数为44.36，脂肪系数为108.51，亲水性系数为0.048，表明其为疏水性蛋白。CaLepb2 全长序列为1 558bp，其开放阅读序列为507bp，由两个外显子组成，可编码168aa，非编码序列包括325bp 的5’-UTR、694bp 的内含子序列及32 bp 的3’-UTR（图1D），有趣的是该基因的5’端有一个（AC）n 的微卫星。CaLepb2 编码的氨基酸序列包含20 个信号肽和3 个半胱氨酸残基。预测所得蛋白分子量为19.20ku，理论pI 为6.20，不稳定系数为49.38，脂肪系数为109.11，亲水性系数为0.019，表明其为疏水性蛋白。

2.3 鲤Lepb 基因的克隆及序列分析

Tang 等[5]只克隆鲤Lepb 基因的一种亚型，使用的引物对恰好位于开放阅读框的起始处和结束处。本研究中以表1 中5、8 引物对扩增获得鲤Lepb1（CcLepb1）基因的全长序列，以5、9 引物对扩增获得鲤Lepb2（CcLepb2）基因的全长序列。CcLepb1基因的全长为1 536bp，其开放阅读序列为507bp，由两个外显子组成，编码168 个氨基酸序列，非编码序列包括300 bp 的5’-UTR、695 bp 的内含子序列及34 bp 的3’-UTR（图1E）。所编码的氨基酸序列包含16 个信号肽和3 个半胱氨酸残基。预测所得蛋白分子量为19.25 ku，理论pI 为5.55，不稳定系数为42.30，脂肪系数为107.92，亲水性系数为0.020，表明其为疏水性蛋白。CcLepb2 基因的全长序列为1 553bp，其开放阅读序列为507bp，由两个外显子组成，可编码168 个氨基酸，非编码序列包括269 bp 的5’-UTR、745 bp 的内含子序列及32 bp 的3’-UTR（图1F）。所编码的氨基酸序列也包含16 个信号肽和3 个半胱氨酸残基。预测所得蛋白分子量为19.38 ku，理论pI 为5.18，不稳定系数为39.94，脂肪系数为98.04，亲水性系数为-0.035，表明其为亲水性蛋白。

2.4 Lep 基因的进化

Lep 氨基酸序列相似性比较结果（图2）表明，鲤、鲫、人和斑马鱼间的瘦素氨基酸序列差异很大，即使是同种间的Lepa 与Lepb 间的差异也很明显，但物种内部同一亚型的两个基因具有较高的相似性。鲫CaLepa1 及CaLepa2 间具有高达78.7%的相似性，但与CaLepb1、CaLepb2 的相似性仅为28.2%～29.2%；同样，CaLepb1、CaLepb2 间的相似性可高达91.1%，且与CcLepb1、CcLepb2 的相似性也很高，可达86.3%～95.2%。而本研究所得鲫Lepa、Lepb及鲤Lepb 共计6 个亚型与人Lep 之间的相似性都很低，仅为21.7%～27%。氨基酸序列的多重比对结果（图3）也进一步验证了上述结论，即该基因亚型间序列相似性较低，而亚型内序列相似性较高。

图2 鲫、鲤、斑马鱼与人Lep 氨基酸同源性比较Fig.2 Comparative homology of Lep amino acid sequences in crucian carp,comm on carp,zebrafish and human

图3 鲫、鲤Lep 氨基酸序列的多重比对Fig.3 Multiple alignment of Lep amino acid sequences in crucian carp and common carp

图4 基于硬骨鱼及其他四足动物的Lep 基因序列同源性分析构建的进化树Fig.4 Phylogenetic tree of crucian carp and other tetrapod based on Lep using the Neighbor-joining method

利用Mega3.1 软件中的N-J 法构建硬骨鱼及其他四足动物的Lep 基因系统发育树，所用到物种包括鲫、鲤、斑马鱼、人、非洲爪蟾Xenopus laevis、小鼠Mus musculus、斜带石斑鱼Epinephelus coioides、青鳉Oryzias latipes、大西洋鲑Salmo salar、草鱼Ctenopharyngodon idella、鳜Siniperca chuatsi。结果如图4 所示，所有脊椎动物的Lep 基因聚为3 支，其中一支为人和四足动物的Lep 基因，硬骨鱼类Lepa、Lepb 则分别聚为一支，硬骨鱼类Lepa 和Lepb的分化出现在硬骨鱼类与四足动物分化之后。如图4 所示，鲤鲫Lepa1、Lepa2 与其他硬骨鱼的Lepa 聚集成一支，鲤鲫Lepb1、Lepb2 则与其他硬骨鱼的Lepb 聚类。

2.5 Lep 蛋白质三级结构预测

大多数硬骨鱼的Lep 基因在结构上十分保守的，本研究所获得鲫、鲤Lep 基因的六个亚型均只有长度相似的两个外显子。不同的是，鲫Lepa 两亚型的内含子长度要明显的短于鲫Lepb 及鲤Lepb亚型。

图5 鲫与人Lep 三级结构Fig.5 Tertiary structure of crucian carp and human Lep

三级结构预测表明，四个亚型的Lep 三级结构都非常保守，且与人Lep 相似，都具有四个反向平行的α-螺旋，形成独特的四螺旋结构，同时还含有一个由两个半胖氨酸形成的二硫键，用以连接α-螺旋的羧基末端（图5）。这些研究结果与Murashita 等的结论相一致，虽然基因亚型间一级结构差异很大，但三级结构高度保守，提示这种结构可能对Leptin 行使生物学功能起关键作用[6]。

3 讨论

1994 年，Zhang 等人首次利用图位克隆技术得到了小鼠的瘦素基因（Lep），直到2005 年Kurokawa等从红鳍东方鲀Takifugu rubripes 中才首次克隆得到变温动物的Lep 基因[1,2]。随着分子生物技术的成熟和脊椎动物基因组学研究的快速发展。近十几年间，数十种鱼类包括青鳉Oryzias latipes、石斑鱼Epinephelus coioides、鲤、斑马鱼、大马哈鱼Oncorhynchus keta、虹鳟Oncorhynchus mykiss、团头鲂Megalobrama amblycephala、草鱼Ctenopharyngodon idella、北极鲑Salvelinus alpinus、大西洋鲑Salmo salar、鲈Morone saxatilis、黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco、尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus、翘嘴鳜Siniperca chuatsi 等及一些两栖动物的Lep 基因被先后获取[3,6,7-18]。有趣的是，很长一段时间里，鸟类和爬行类被认为缺失Lep 基因，但是近些年的研究表明，鸟类和爬行类同样存在Lep 基因[19]。本研究的Lep 氨基酸同源性比较结果表明，除近缘类群的Lep 基因DNA 和氨基酸序列相似性较高外，脊椎动物的Lep 基因一级结构并不保守。例如红鳍东方鲀的Lep 基因与哺乳动物人、小鼠的Lep 基因的相似性仅为17.5%，这可能是以小鼠或人的Lep 为参照基因获取鱼类等其他脊椎动物Lep 相当困难的原因。

现已在斑马鱼、青鳉、石斑鱼、草鱼、鲤及翘嘴鳜、虹鳟等真骨鱼类中均得到Lepa 与Lepb 两种不同的基因亚型[3,5,8,12,20,21]。本研究中脊椎动物Lep 基因可以聚为3 支，其中真骨鱼类具有两支，分别对应于Lepa 和Lepb，其余脊椎动物聚为一支。这一结果支持真骨鱼类的共同祖先相较其他脊椎动物多经历了一轮基因组加倍。真骨鱼类因而有两拷贝的Lep 基因，而其他的脊椎动物则只有一份拷贝[22]。大量的研究表明：虹鳟等鲑科鱼类、鲤鲫等鲤亚科鱼类是古四倍体鱼类，本研究克隆得到鲤鲫Lep 基因预期的全部四种亚型，符合这一推断[23]。有学者也克隆到鲑科加倍Lep 基因，进化分析表明：鲑科和鲤亚科鱼类的基因组加倍是独立事件，但是，鲤鲫等鲤亚科鱼类应该共享共同的四倍体祖先。

与哺乳动物相比，鱼类中Lep 基因的功能研究仍处于初级阶段。现有的研究结果表明，鱼类Lep具有调节能量代谢、控制食物摄入、促进脂肪降解、调节食欲、调控繁殖发育以及影响衰老等生物学功能[16,24-29]。本研究成功分离获得鲫Lep 基因的四个亚型CaLepa1、CaLepa2、CaLepb1 和CaLepb2，进一步证实鲤也具有四个Lep 基因亚型，为后续深入研究鲤鲫等鱼类Lep 基因不同亚型的生物学功能奠定了基础。