标记指导大规模混合家系选育技术应用实例

鲁翠云，李超，曹顶臣，匡友谊，郑先虎，李崇文，孙效文

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070;2.天津市天祥水产有限责任公司，天津 301500）

近年来，鲤Cyprinus carpio、鲫Carassius auratus、草鱼Ctenopharyngodon idellus、鲢Hypophthalmichthys molitrix 和鳙Aristichthys nobilis 等我国主要养殖鱼类基因组资源迅速积累，相继开发了大量的共显性标记，建立了遗传连锁图谱，发掘出了与重要经济性状相关的数量性状位点（QTL）标记。孙效文等[1]将分子育种技术定义为在群体、家系或个体选择中使用了基因或标记的育种技术。按照其观点，我国主要养殖鱼类均具备了开展分子育种研究的条件。利用分子标记揭示亲本个体间的遗传差异，指导繁殖配组的分子育种技术已经在鲤[2]、牙鲆Paralichthys olivaceus[3]、红鳍东方鲀Takifugu rubripes[4]、大黄鱼Larimichthys crocea[5]等鱼类中应用，开发了分子标记指导的家系选育、群体选育、遗传结构优化等一系列切实可行的分子育种技术路线[6]，取得了良好的选育效果[7,8]。既利用表型数据又利用基因型数据的分子育种技术是育种的换代技术，具有巨大的应用潜力与优势。

混合家系选育及群体选育是鱼类育种中常用的技术，但是，其繁殖的子代系谱不清，连续几代繁殖后近亲衰退严重。基于亲本遗传背景的分子育种技术虽然可以解决这一难题，但是，有2 个因素制约了其推广应用：一是用分子标记区分大量家系混合群体的工作量巨大，很难准确鉴别数百个家系。目前，用分子标记区分的最大的家系数目是245个[9]，限制了育种的强度；二是在苗种价值较低的鱼类中应用此法投入巨大，不利于在基层育种单位推广。本研究将家系选育的准确性和群体选育的易操作性相结合，建立了标记指导的大规模混合家系选育技术，利用“优选法”理念，不以鉴别和区分家系为目的，而是利用表型选择获得优良的核心群体后，用分子标记鉴定选择的个体的系谱关系。以镜鲤的选育为例，具体介绍了该技术的操作流程和简要技术路线（图1）。该技术方案避免了近亲交配，简化了育种步骤，减轻了工作量，提高分子育种技术的可操作性，可适应不同生产条件的分子育种工作。

1 材料与方法

1.1 材料

镜鲤亲本繁育群体为分子标记指导家系选育的F1代[2]，来自黑龙江水产研究所呼兰实验站。亲本的选择包括外观选择、表型数据选择、分子标记选择，具体选择标准及详细实验步骤参照文献[6]。选择3+龄亲本334 尾，雌鱼210 尾，雄鱼124 尾，平均体质量2 314.44g，平均体长39.71cm。电子标记后，按参考文献[2]方法取鳍条，提取基因组DNA。

根据亲本个体间的遗传差异，以繁殖组内任何一对雌、雄鱼间无近亲交配关系为原则设计家系配组，建立大规模组间混合家系繁殖子代。繁育的部分苗种依托天津市天祥水产有限责任公司养殖和选育，经过2 个年度的系统培育和选育，形成了F2代繁殖的核心群体300 尾，电子标记后，采集鳍条样本，提取基因组DNA。

1.2 引物与试剂

选取20 个与体长、体质量、体高、饲料转化率等[10-13]生长性状相关的QTL 标记检测了F1和F2亲本个体间的遗传差异。引物由上海生工生物工程公司（简称上海生工）合成，引物信息见表1。实验所用的Taq DNA 聚合酶、dNTP 及生化试剂均购自上海生工。

1.3 PCR 扩增及检测

15μL PCR反应体系含10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），50 mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，dNTP 各200 μmol/L，微卫星上下游引物各5 pmol，Taq DNA聚合酶1U，DNA 模板100 ng。反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30s，51～60℃复性30 s，72℃延伸30 s，27 个循环；最后72℃下延伸5min。扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，用Gel-Pro Analyzer 4.5 软件分析电泳条带的大小。

1.4 数据处理

微卫星是共显性遗传，可从凝胶电泳图谱上直接判断出个体的基因型，用自主开发的“鱼类种质资源遗传分析平台（专利号：ZL200710144749.3）”处理个体间遗传数据，将其转化为PHYLIP 3.6 识别数据格式，用PHYLIP 3.6 软件的gendist 程序计算个体间的遗传距离，用neighbor 程序绘制聚类图，经过1 000 次抽样自举检验，选定唯一聚类图，用自主开发的计算机软件“基于遗传背景的分子育种软件1.0（登录号：2011SR091052）”划分繁殖系谱，组间雌雄个体交叉进行配组繁殖混合家系，以避免近亲繁殖。

图1 标记指导大规模混合家系选育技术路线简图Fig.1 Technical route diagram of large-scale mixed family selection assisted by microsatellite markers

表1 本研究用的微卫星引物及其序列Tab.1 Sequences of microsatellite primers used in the experiment

2 结果与分析

2.1 镜鲤F1亲本个体间的遗传差异

用20 个微卫星标记分析了镜鲤亲本个体间的遗传差异，用PHYLIP 3.6 软件包内的gendist 程序计算了个体间的遗传距离在0.0120～2.0794 之间。neighbor 程序绘制的聚类结果显示，多数亲本个体具有相似的遗传背景，个体间遗传分化程度较小。其中328 个个体在相同节点处聚成74 个分支，多数个体以2～5 个个体聚为一支，占全部分支的79.73%，其中43.28%的个体遗传距离处于0.4～0.7的范围之内（图2），适合作为亲本繁殖下一代，而存在近亲交配风险的个体数仅占7.90%。

以分支间雌雄个体交叉进行群体繁殖，控制每对亲本配组的遗传距离位于0.4～0.7 之间，建立大规模混合家系。当年累计建立了约500 个混合家系，获得F2苗种约100 万尾，其中约30 万尾由天津市天祥水产有限责任公司养殖及选育，作为下一代繁殖用的后备亲鱼。

2.2 子代混合家系的培育及选育

图2 F1亲本个体间遗传距离范围分布图Fig.2 Distribution diagram of genetic distance range among F1parental individuals

约30 万尾超大混合家系F2代鱼苗运往天津市天祥水产有限公司养殖和培育，当年10 月（1-龄鱼种）和次年10 月（2-龄成鱼）选优去劣，由经验丰富的养殖技术人员选择留取体型优良、生长优势明显、鳞被规范的个体，最终获得F2代的2 龄备选亲鱼300 尾,雌性200 尾，雄性100 尾，平均体质量（1 564.93±335.05）g，平均体长（35.85±3.10）cm，累计留种比例为1 000∶1。各阶段选育的群体体质量性状及留种情况见表2。

2.3 优良个体的系谱分析

对选出的300 尾后备亲本进行电子标记，采集鳍条样本，用20 个与生长性状相关的微卫星标记分析基因型，利用“基于遗传背景的分子育种软件1.0”将其中的288 尾个体划分到20 个繁殖系谱，每个繁殖系谱含有9～21 个个体，平均体质量（1 441.67±99.35）～（1 783.57±150.14）g，平均体长（34.37±0.59）～（37.32±1.08）cm，其中15 个繁殖系谱的平均体质量达到了预定规格（1 500 g）以上，占75%（图3）。

表2 F2代大规模混合家系养殖及选育过程Tab.2 The rearing and breeding process of large-scale mixed family of F2generation in mirror carp

图3 20 个繁殖系谱体质量性状比较Fig.3 Comparative analysis of body weight among twenty breeding pedigrees

3 讨论

电子标记辅助的大规模家系选育技术已经成功用于挪威大西洋鲑Salmo salar 和美国优质虹鳟Oncorhynchus mykiss 的选育[14]，但是，其构建上百个家系，先分池饲养，然后电子标记混合饲养的技术路线并不适用于我国，尤其不适用于产卵量大、苗种价格低、投入低的鲤科鱼类的苗种生产及培育。本研究结合了大规模家系选育的优点，利用分子标记揭示的亲本个体间的遗传差异辅助构建混合家系，在苗种阶段即同池混合饲养，通过多次的表型选择[6]，保留生长及体型优良的个体，形成后备亲鱼；再次使用分子标记鉴定优良个体的繁殖系谱，下一代繁殖时，以繁殖系谱间亲鱼配组，最大限度地避免了近亲繁殖又简化了操作步骤，获得了最大的选择强度和选择效果。

开展鱼类家系选育的关键是选择配组亲本，难点是大规模家系的混合群体中鉴定出优良家系或确定繁殖系谱。利用分子标记揭示的亲本间遗传差异指导家系配组在作物[15,16]及畜禽[17]中已广泛应用。在水产动物中，鲁翠云等[2]用微卫星标记指导镜鲤家系亲本的配组，显示亲本间遗传距离在0.5～0.7之间的子一代具有较好的生产性能。毕金贞等[3]研究发现，牙鲆亲本间遗传距离在0.2578～0.5958 范围内，与后代生长速度之间呈显著正相关（P＜0.05）。常玉梅等[5]用遗传差异指导群体繁殖的大黄鱼的生产性能和抗逆性比对照组有较大提高。孙效文等[6]通过连续多年的实验，提出镜鲤雌雄亲本配组亲缘关系的阈值是“遗传距离小于0.2、大于0.7 的1 对雌雄个体不适合繁殖配组，最佳配组雌雄个体的遗传距离范围为0.5～0.7。而利用微卫星标记鉴定混合养殖家系的系谱关系也已在中国明对虾Fenneropenaeus chinensis[18]、大菱鲆Scophthalmus maximus[19]、马氏珠母贝Pinctada martensii[20]等水产动物育种中应用。本研究将微卫星标记与大规模混合家系选育技术相结合，利用微卫星标记揭示的亲本间遗传差异指导建立大规模混合家系，将大多数亲本个体聚为74 个组，其中43.28%的个体间遗传距离处于0.4～0.7 的范围之内，适合用于家系的繁殖配组，组间雌雄交叉繁殖混合家系约500 个，达到了大规模家系选育的程度。经过2 整年的表型选择，获得了第二代后备亲鱼，选择强度达到了1‰，再次用微卫星标记结合配组软件将后备亲鱼中的大部分优良个体划归20 个繁殖系谱，为下一代的繁殖配组奠定了基础。

近年来，我国多数主要养殖鱼类相继开发了大量的共显性标记，具备了开展基于遗传背景的分子育种研究的条件，开展分子育种将是水产养殖动物育种研究的一种趋势和方向，多家系混合选育可以消除环境差异的影响，也将是分子育种的重要技术程序。但如果从几百个家系的混合群体中将所有家系区分开来将是一个成本高、工作量巨大的检测工作，如本研究使用500 个家系，要区分这些家系，每个家系用30 个个体就要15 000 个个体，用20 个标记鉴定也要获得30 万个基因数据，其分析工作量非常巨大，检测成本也将达到上百万元。本研究介绍的标记指导的大规模混合家系选育技术，借鉴“优选法”理念，不以鉴别和区分所有家系为目标，放弃了对所有实验家系进行系谱分析或亲权鉴定，而是在1 龄和2 龄各利用表型选留一次后备亲本，仅深入分析目标性状优秀的个体，例如开展繁殖系谱划分、亲权关系鉴定、全基因组重测序等，减少了基因型分析的工作量，既节省了成本，也达到了利用分子标记辅助建立优良后备亲鱼群体的目标，是一个选择强度大的实用分子育种技术方案。