大鼠海马CA1区-杏仁核大麻素受体信号通路对糖尿病大鼠摄食及胃运动的影响

闫菲　冷慧　王茜　孙向荣　郭菲菲　徐珞

【摘要】 目的：本實验主要探究了大鼠海马CA1区-杏仁核（BMA）大麻素受体信号通路对糖尿病大鼠摄食及胃运动的影响。方法：通过免疫组织化学染色方法确定大鼠海马CA1区是否表达大麻素受体，以及海马CA1区-BMA是否存在纤维投射;通过向大鼠海马CA1区注射大麻素、大麻素受体拮抗剂利莫那班（Rimonabant）及GLP-1受体激动剂Exendix-4，测定大鼠0～4 h及4～8 h摄食量改变，以及对胃运动的影响;观察大麻素及GLP-1受体激动剂Exendix-4对糖尿病大鼠胃牵张（GD）敏感神经元放电活动的影响。结果：免疫组织化学染色结果证实了海马CA1区存在大麻素受体，且海马CA1区-BMA之间存在纤维投射;通过向大鼠海马CA1区注射大麻素、大麻素受体拮抗剂Rimonabant及GLP-1受体激动剂Exendix-4能够减少食物摄入并抑制大鼠胃运动;海马CA1区微量注射大麻素后，正常大鼠GD敏感神经元放电频率显著增加，该效应可被大麻素受体拮抗剂Rimonabant完全阻断，Exendix-4可部分阻断大麻素的促放电效应;与正常大鼠相比，海马CA1区微量注射大麻素后糖尿病大鼠GD敏感神经元放电频率均显著增加（P<0.05）;海马CA1区微量注射大麻素后，大鼠胃运动幅度和频率均显著增加，但糖尿病大鼠胃运动增加更加显著。结论：大鼠海马CA1区存在大麻素受体，且海马CA1区-BMA大麻素受体信号通路参与调节大鼠摄食及胃运动。

【关键词】 海马CA1区; 杏仁核; 大麻素受体; 摄食; 胃运动

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.23.001 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2019）23-000-06

【Abstract】 Objective：To explore the influence of cannabinoid receptor signaling pathway in rat hippocampal CA1 area-amygdala（BMA） on feeding and gastric motility in diabetic rats.Method：Immunohistochemical staining was used to observe whether the cannabinoid receptor was expressed in the hippocampal CA1 region and whether there was fiber projection from the hippocampal CA1 region to the BMA.The cannabinoid，cannabinoid receptor antagonist Rimonabant and GLP-1 receptor agonist Exendix-4 were injected into the hippocampal CA1 region of rats to determine the food intake during 0-4 h and 4-8 h，and the effects on gastric motility.Administrated cannabinoids and GLP-1 receptor agonist Exendix-4 into the hippocampal CA1 area to observe the effects of gastric distraction（GD）-sensitive neurons in diabetic rats.Result：Immunohistochemical staining showed that cannabinoid receptors expressed in the hippocampal CA1 region，and there was fiber projection from the hippocampal CA1 region to the BMA.Administrated cannabinoids and the GLP-1 receptor agonist Exendix-4 into the hippocampal CA1 region of rats could reduce food intake and inhibit gastric motility in rats.After microinjection of cannabinoids in the hippocampal CA1 area，the discharge frequency of GD-sensitive neurons in normal rats increased significantly.This effect was completely blocked by the cannabinoid receptor antagonist Rimonabant，and Exendix-4 partially blocked the promoting discharge effect of cannabinoids.Compared with normal rats，the discharge frequency of GD-sensitive neurons in diabetic rats was significantly increased after microinjection of cannabinoids in hippocampal CA1 area（P<0.05）.After microinjection of cannabinoids in the hippocampal CA1 area，the amplitude and frequency of gastric motility in rats increased significantly，but the diabetic rats gastric motility was increase more significant.Conclusion：Cannabinoid receptors are expressed in the hippocampal CA1 region of diabetic rats，and the hippocampal CA1 region-BMA cannabinoid receptor signaling pathway is involved in the regulation of feeding and gastric motility in rats.

【Key words】 Hippocampal CA1 area; Amygdala; Cannabinoid receptor; Food intake; Gastric motility

First-authors address：School of Basic Medicine，Qingdao University，Qingdao 266021，China

20世纪90年代，研究人员在探究大麻衍生复合物-Δ9-四氢大麻酚的作用机制过程中发现了内源性大麻素系统[1]。大麻素分为三大类，从天然植物中提取的大麻素、人工合成的大麻素和内源性大麻素，该系统失衡与多种中枢神经系统和免疫系统疾病有关[2-3]。先前研究表明，大麻素系统在脂肪形成中发挥重要作用，大鼠及人促脂肪细胞的大麻素受体1（CB1）刺激作用通常伴有大麻素mRNA的上调[4]。而CB1阻断剂能够抑制大鼠脂肪细胞的增殖，因此随着中枢CB1信号的传递，大鼠脂肪细胞CB1刺激作用保证了脂肪组织中的脂肪细胞有充足的脂肪储存[5-7]。

如今，由于糖尿病及肥胖症患病率的快速增加，糖尿病及肥胖已经成为全球性健康问题[8-10]。研究表明，大鼠中枢神经系统与外周器官之间存在密切的神经联系，以此调节大鼠摄食及胃运动[11-12]。目前，针对肥胖的更有效的治疗方法是胃切除手术，这表明胃肠道信号是调节能量稳态的关键因素[13-15]。尽管先前研究主要集中在不同的外周信号对大鼠体重及摄食调节中的相关作用，但尚未阐明控制该作用的中枢调控机制[16-18]。内源性大麻素水平是衡量大麻素系统活性的主要指标[19]。内源性大麻素及其受体在人体内发挥多种代谢调节作用，参与免疫调节、心血管调节、能量代谢等相关疾病的病理过程，然而，对于外源性大麻素对大鼠摄食及胃运动的中枢调控尚不明确[20-23]。此外，胰高血糖素（GLP）系统在糖尿病大鼠中与大麻素系统存在密切联系，同时在大鼠摄食及胃运动中发挥重要作用[24-26]。GLP-1与大鼠肥胖也存在密切联系，尤其是GLP-1受体激动剂Exendix-4[27-28]。因此，探究外源性大麻素在中枢调控中对大鼠摄食及胃运动的影响，以及GLP-1信号通路是否参与其中十分重要，这对于进一步研究大麻素系统临床药物的研发及肥胖症的靶向治疗具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年雄性Sprague Dawley大鼠，体质量在220～250 g，所有大鼠均在室温（25±2）℃、12 h∶12 h昼夜循环光照、实验室标准饮食及自由进食和饮水的环境中饲养。实验开始前大鼠禁食24 h，但可自由饮水。海马CA1区内注射药物后，大鼠自由摄食和饮水。所有动物实验均严格按《青岛大学实验动物保护和使用管理办法》执行。

1.2 荧光金逆行追踪和免疫组织化学染色

大鼠腹腔注射硫代巴比妥醇（100 mg/kg）麻醉并固定在立体定位装置（Narashige SN-3，Tokyo，Japan）上，将0.2 μl的3%（W/V）荧光金（FG;溶解在蒸馏水中）注射至杏仁核（BMA）中。7 d后，大鼠腹腔注射硫代巴比妥醇（100 mg/kg）麻醉，将麻醉的大鼠固定于操作台上，先后给予250 ml 生理盐水和250 ml 4%的多聚甲醛灌注固定。将大鼠断头取脑后，置于4%多聚甲醛中4～6 h进行后固定，再置于30%蔗糖溶液脱水（4 ℃）。冰冻切片机连续冠状切片（Kryostat 1720，Leica，Germany），片厚15 μm，所有切片放于-20 ℃冰箱冻存。

选取海马CA1区域较大的切片，先后用双蒸水和0.01 mol/L PBS洗涤各3次，每次5 min，之后浸入柠檬酸修复液中微波修复5 min，至气泡逸出。用正常羊血清封闭非特异性抗原（室温孵育1 h），滴加一抗，即抗-CB1R抗体（兔来源，1∶200稀释，Delaware Ave，Santa Cruz，USA），将加好一抗的标本置于湿盒中，4 ℃过夜。PBS溶液洗涤3次，然后滴加荧光素CY3标记的二抗（山羊抗兔，1∶500稀释，Abcam，London，UK），室温孵育2 h（避光操作）。淬灭油封片后，在BX50荧光显微镜（Olympus，Tokyo，Japan）下觀察实验结果并拍照。

1.3 糖尿病大鼠模型制备

SD大鼠，体重220～250 g，适应性饲养1周后，禁食12 h，单次腹腔注射35 mg/kg的链脲佐菌素（STZ，sigama）。STZ用灭菌的0.1 mmol/L，pH 4.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配成2%的溶液，现配现用。72 h后取尾静脉血测空腹血糖高于7.0 mmol/L和餐后血糖均高于11.1 mmol/L为糖尿病大鼠建模成功。一次注射未成模，立即按原剂量补注一次STZ后，未成模者或成模后缓解者淘汰。

1.4 脑核团置管

大鼠腹腔注射硫代巴比妥醇（100 mg/kg）麻醉后固定于脑立体定位仪，根据Paxinos&Watson大鼠脑图谱用微量注射仪定位[11]，以前囟为零点，定位海马CA1区（前囟后4.2 mm，旁开2.0 mm，颅骨下2.8 mm）和BMA（前囟后2.2 mm，旁开4.0 mm，颅骨下9.0 mm），用牙科钻钻孔，将一不锈钢套管置于海马CA1区，用牙科粘固剂固定，不锈钢管探针封闭导管，缝合头皮切口[29]。大鼠分笼饲养，自由饮食饮水。手术结束后大鼠连续3 d给予腹腔注射8万U青霉素以防止术后感染。大鼠恢复1周后开始实验。

为了检测核团或侧脑室定位是否准确，实验结束后经套管向大鼠海马CA1区内缓慢注射滂胺天蓝溶液，随后麻醉大鼠，经心脏灌注固定，断头取脑，50 μm冠状冰冻切片，显微镜下观察药物注射的位置是否准确。

1.5 摄食量测定

在实验中选取正常大鼠和糖尿病大鼠，随机分为6组（每组6只），（1）NS组：海马CA1区注射0.5 μl生理盐水;（2）CB1组：海马CA1区注射0.5 μl 0.2 mg/kg CB1;（3）Rimonabant组：海马CA1区注射0.5 μl 3 mg/kg Rimonabant;（4）Exendix-4组：海马CA1区注射0.5 μl 2.5 μg/kg Exendix-4;（5）Rimonabant+CB1组：海马CA1区注射0.2 mg/kg CB1与3 mg/kg Rimonabant混合液;（6）Exendix-4+CB1组：海马CA1区注射0.2 mg/kg CB1与2.5 μg/kg Exendix-4混合液。大鼠禁食18 h，在实验开始前1 h将大鼠放置在摄食测量笼内，使大鼠适应实验环境。注射药物或生理盐水后立即给予大鼠定量食物。给药后测量大鼠0～4 h和4～8 h摄食量。

1.6 GD敏感神经元细胞外放电记录

五管玻璃微电极中一管为记录电极，充有2%的滂胺天蓝和0.5 mol/L乙酸钠，其他四管连接到四通道压力注射器，分别充以0.5 μl  0.2 mg/kg大麻素、3 mg/kg Rimonabant、2.5 μg/kg Exendix-4及生理盐水，通过短脉冲气体压力（1 500 ms，5.0～15.0 psi）将药物喷洒到细胞表面上。使用液压推进器将微电极送至后，记录的电信号经MEZ8201型微电极放大器输入VC-11双道示波器，经SUMP-PC生物信号系统进行放电频率处理与分析。当玻璃微电极进入海马CA1区后，搜寻海马CA1区内神经元，并开始记录细胞外的放电活动。待放电频率稳定后（至少记录120 s），注入3～5 ml的温生理盐水至胃腔薄软胶气囊中，持续扩张胃壁10～30 s，观察神经元放电频率的变化，鉴别胃牵张（gastric distension，GD）敏感神经元，以神经元放电频率的变化率超过20%作为神经元兴奋或抑制指标，神经元表现兴奋的确定为胃牵张兴奋型神经元（GD-E），表现为抑制的确定为胃牵张抑制型神经元（GD-I）。

1.7 胃运动记录

空腹大鼠麻醉后仰卧位固定于手术台上，腹部皮肤备皮。剑突下行行腹部正中切口，切口长约1 cm，暴露胃部。在幽门向上0.3 cm处，沿胃环行肌方向将应力传感器缝贴于胃窦的浆膜外，传感器导线由皮下行至后颈部，经皮肤切口穿出体外（留置2～3 cm导线用于连接记录仪）并固定。逐层缝合腹壁肌肉和皮肤。术后每日腹腔注射青霉素2万单位，预防感染。3 d后大鼠恢复正常饮食且无任何疼痛或应激反应，即可实验。

大鼠禁食18 h，自由饮水。实验时，首先将大鼠置于记录用鼠笼内适应环境1 h。胃运动由应力感受器传至胃肠运动换能器，在此转变为电信号输入计算机，由Powerlab多道生物信号采集处理系统对胃肠运动数据进行处理。刺激前稳定记录大鼠胃运动30～60 min。同一只大鼠两次记录至少间隔1天。胃运动变化采用平均为运动指数%（%MI）表示，%MI计算公式为：处理后曲线下面积/处理前的曲线下面积×100%。

1.8 统计学处理

用SPSS 18.0和PPMS 1.5软件分析数据，所有数据均以（x±s）表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，两组间样本均数比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 海马CA1区-BMA纤维投射及CB1受体的表达

免疫荧光组织化学实验结果显示，海马CA1区与BMA之间存在纤维投射，且海马CA1区表达CB1R，见图1。

2.2 海馬CA1区注射CB1对大鼠摄食的影响

在正常大鼠中，与NS组相比，海马CA1区注射CB1可显著促进大鼠0～4 h的摄食量（P<0.05）;但对于4～8 h摄食量无显著改变（P>0.05）;而预注射Rimonabant可阻断CB1的促摄食作用。然而，单独注射Rimonabant对摄食没有明显影响（P>0.05）;与NS组相比，海马CA1区注射Exendix-4可显著抑制0～4 h的摄食量（P<0.05）;海马CA1区注射CB1和Exendix-4混合液时，与单独注射CB1相比，0～4 h摄食量显著降低（P<0.05），见表1。

在糖尿病大鼠中，与NS组相比，海马CA1区注射CB1后，0～4 h的摄食量显著增加（P<0.01）;与CB1组相比，预先注射Rimonabant可阻断CB1的促摄食作用（P<0.05）;海马CA1区联合注射CB1和Exendix-4时，与单独注射CB1相比，0～4 h摄食量显著降低（P<0.05），见表1。

在两组大鼠中，与正常大鼠相比，海马CA1区注射CB1后糖尿病大鼠0～4 h摄食量显著增加（P<0.05），且高于正常大鼠，见表1。

2.3 海马CA1区注射CB1对糖尿病大鼠GD敏感神经元放电活动的影响

在35只糖尿病大鼠中海马CA1区记录到127个放电神经元，其中86个（86/127，67.72%）神经元对胃牵张有反应被鉴定为GD敏感性神经元。在86个GD敏感神经元中，48个（48/86，55.81%）神经元放电频率显著增加，鉴定为GD-E神经元;而另外38个（38/86，44.19%）神经元被抑制，鉴定为GD-I神经元。

在48个GD-E神经元中，海马CA1区微量注射CB1，29个神经元（29/48，60.42%）放电活动增加[（3.78±0.67）Hz

vs （6.47±1.21）Hz]，平均增加71.16%±4.2%（P<0.01）;38个GD-I神经元中有17个（17/38，44.74%）神经元放电频率显著增加（2.96±0.58）Hz vs （4.97±1.09）Hz，平均增幅67.91%±2.7%（P<0.01），见图2。若海马CA1区内预先注射CB1受体拮抗剂Rimonabant可完全阻断CB1诱导的促放电作用，表明CB1可能通过作用于其受体CB1R调节GD敏感神经元的活动;单独注射Rimonabant对GD敏感神经元的活动无显著影响（P>0.05）;此外，预先向海马CA1区注射Exendix-4，再给予CB1，发现CB1对GD-E或GD-I神经元的促放电作用可被Exendix-4部分阻断（P<0.05），见表2。

2.4 CB1對糖尿病大鼠胃运动的影响

在糖尿病大鼠中，海马CA1区直接注射生理盐水，大鼠胃收缩的幅度和频率无明显改变（P>0.05）;与NS组相比（n=8），大鼠海马CA1区微量注射CB1能够显著促进大鼠胃收缩的幅度和频率（P<0.05）;而大鼠海马CA1区中预注射Rimonabant，CB1对胃运动的促进作用可被完全阻断（P<0.05）;此外，预先向海马CA1区注射Exendix-4，再给予CB1，发现CB1对胃运动的促进作用可被Exendix-4部分阻断（P<0.05），见表3。

3 讨论

在本研究中，笔者探究了大鼠海马CA1区-杏仁核CB1受体信号通路和GLP-1受体信号通路对正常大鼠及糖尿病大鼠摄食及胃运动的影响，同时探究了对糖尿病大鼠GD敏感神经元的影响。先前研究中发现，糖尿病大鼠摄食量高于正常大鼠，但是具体机制尚不明确[6]，因此需要进一步的研究来阐明糖尿病大鼠摄食及胃运动的中枢调控机制。

笔者的研究结果显示，大鼠海马CA1区注射CB1可引起该区域中大多数GD-E和GD-I神经元的激活。CB1受体拮抗剂Rimonabant阻断了CB1引起的这些效应。此外，这些效应可被GLP-1受体拮抗剂Exendix-4调节。CB1与GLP-1受体拮抗剂Exendix-4联合应用可引起大鼠食物摄入量改变。在研究中，笔者猜测CB1和大脑中的GLP系统可能在大鼠摄食及胃运动中起关键作用。

先前研究表明，CB1可促进大鼠摄食、觉醒或应激反应等[30]。在这项研究中，笔者证明大鼠海马CA1区注射CB1可促进大鼠食物摄入，这与先前研究一致。并且CB1受体拮抗剂Rimonabant可完全阻断CB1诱导的摄食增加。因此笔者认为CB1可能是通过海马CA1区CB1受体发挥促摄食作用。此外，免疫组织化学染色结果显示，大鼠海马CA1区存在CB1受体，且海马CA1区以杏仁核之间存在纤维投射，并且海马CA1区中FG免疫阳性神经元与CB1受体神经元存在共定位，这为笔者的研究提供了重要的解剖学基础。除此之外，先前研究显示，GLP-1系统在糖尿病大鼠的摄食及能量代谢过程中发挥重要作用[31]，因此，笔者研究发现，向大鼠海马CA1区注射GLP-1受体拮抗剂Exendix-4可部分阻断CB1的促摄食作用。

此外，笔者研究发现，向糖尿病大鼠海马CA1区注射CB1能够增加海马CA1区GD敏感神经元的放电活动，且CB1受体拮抗剂Rimonabant可完全阻断CB1诱导的促放电活动增加，向大鼠海马CA1区注射GLP-1受体拮抗剂Exendix-4可部分阻断CB1的促摄食作用，这进一步说明中枢CB1受体信号通路能够参与调控大鼠胃运动。

糖尿病与肥胖疾病及食欲行为关系密切，这些行为主要是由中枢及外周相关通路参与调控，未来的研究中需要进一步的探究不同剂量肽对中枢系统及能量代谢之间相互作用的影响。在本研究中，观察到的CB1R受体信号通路和GLP-1系统间的相互作用，这表明，CB1R拮抗剂和GLP-1受体拮抗剂之间可能存在潜在的协同作用，可用于治疗糖尿病患者摄食过多和其他肥胖相关疾病。CB1R拮抗剂和GLP-1受体拮抗剂的联合给药可能为治疗这些疾病提供一种新的药理学策略。

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（收稿日期：2019-07-04） （本文編辑：何玉勤）