杏仁核在脑梗死合并心律失常中的作用

贾淑伟 王玲 焦润生

[摘要] 目的 探讨杏仁核在脑梗死合并心律失常中的作用及可能機制。 方法 为观察脑梗死后杏仁核神经元活动的变化，将48只大鼠随机平均分为假手术组，脑梗死后30 min、1 h、2 h、4 h和8 h组。为观察谷氨酸在脑梗死诱发心律失常中的作用，另取40只大鼠随机平均分为空白对照组、生理盐水组、L-谷氨酸组、MK-801预处理后侧脑室注射L-谷氨酸组和MK-801预处理后再进行中动脉栓塞（MCAO）组。通过大鼠大脑MCAO建立脑梗死模型，用生物信号采集系统采集心电图，用Fos蛋白作为神经元激活标志物。 结果 假手术组心律失常的发生率为0，脑梗死组心律失常的发生率为78.75%，明显高于假手术组（P < 0.01），且在心律失常发生的相应时间点杏仁核Fos蛋白表达明显增加（P < 0.01）。空白对照组和生理盐水组心律失常的发生率均为0，L-谷氨酸组心律失常的发生率为87.5%，明显高于空白对照组（P < 0.01），且L-谷氨酸组杏仁核Fos蛋白表达明显增高（P < 0.05）。MK-801预处理后MCAO组和MK-801预处理后侧脑室注射L-谷氨酸组心律失常的发生率均为0，且杏仁核Fos蛋白表达均无明显变化（P > 0.05）。 结论 脑梗死后杏仁核活动的增强可能参与了脑梗死后心律失常的发生发展，且此作用可能由谷氨酸激活门冬氨酸受体所介导。

[关键词] 杏仁核；脑梗死；心律失常；谷氨酸；门冬氨酸受体

[中图分类号] R33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）03（a）-0020-04

[Abstract] Objective To investigate the association between ischemic stroke-induced arrhythmia and the activity of amygdala and the possible mechanism. Methods Forty-eight rats were randomly and equally divided into the following groups： sham-operated group， 30 min， 1 h， 2 h， 4 h， and 8 h after ischemic stroke groups， and the changes of the activity of amygdala neurons in ischemic stroke rats were observed. Forty rats were randomly and equally divided into the following groups： blank control group， saline group， L-glutamate group， MK-801 before L-glutamate and MK-801 preceding making model group， and the effects of glutamate on arrhythmia induced by ischemic stroke were observed. The experimental cerebral ischemic animal model was established by occluding the right middle cerebral artery （MCAO）. The electrocardiography was recorded by a biological signal collecting and processing system. Fos protein was used as an objective indicator to illustrate the functional state of neurons. Results The incidence of arrhythmia in model group was 0， and the sham-operated group was 78.75%， the incidence of arrhythmia in the sham-operated group was significantly higher than that in model group （P < 0.01）， and the expression of Fos protein in the amygdala was also increased significantly during the arrhythmia （P < 0.01）. The incidence of arrhythmia in blank control group and saline group was 0， L-glutamate group was 87.5%， which was significantly higher than blank control group （P < 0.01）， and the expression of Fos protein in the amygdala of the L-glutamate group was also increased significantly （P < 0.05）. The incidence of arrhythmia in both MK-801 preceding making model group and MK-801 preceding L-glutamate group was 0， and the expression of Fos protein had no obvious change （P > 0.05）. Conclusion It is concluded that activation of the amygdala in ischemic stroke rats is likely mediated by glutamate via activation of N-methyl-D-aspartic acid receptors， which causes arrhythmias.

[Key words] Amygdala； Ischemic stroke； Arrhythmia； Glutamate； NMDA receptor

脑梗死合并心律失常是脑梗死猝死的主要原因之一[1]，其起病急、变化快的特点不能用脑疝解释[2]，且许多脑梗死合并心律失常的患者不存在原发心脏病史[3]，提示脑梗死后心律失常的发生源于中枢神经系统的活动异常。杏仁核是前脑内参与自主神经系统和心血管功能活动的重要整合中枢之一[4]。杏仁核受损时，心电图可发生明显改变[5]，通过刺激杏仁核可建立交感源性心律失常动物模型[6]。是否脑梗死后心律失常的发生与杏仁核的活动增强有关？本研究观察了脑梗死后大鼠杏仁核神经元活动的改变，并探讨了其与脑梗死后心律失常发生的相关性及可能的谷氨酸能机制，以期揭示脑梗死合并心律失常的部分中枢机制。

1 对象与方法

1.1 实验动物

雄性健康Wistar大鼠，体重210～250 g，购自哈尔滨医科大学实验动物学部。

1.2 药物与试剂

TTC购自中国医药上海化学试剂公司。GAPDH单克隆抗体购自碧云天生物技术研究所。c-fos多克隆抗體（sc-52，Santa Cruz）购自中杉金桥公司。AP标记马抗小鼠二抗（zd-2310）购自中杉金桥公司。AP标记的山羊抗兔二抗（zb-2308）购自中杉金桥公司。

1.3 仪器

RM6240B生物信号采集系统，中国成都泰盟；大鼠脑立体定位仪SN-3，日本Narishige；石蜡切片机RM2016，德国徕卡；凝胶成像系统，美国Alpha。

1.4 实验分组

48只大鼠随机分为假手术组，脑梗死后30 min、1 h、2 h、4 h和8 h组，每组8只，以观察脑梗死后杏仁核神经元活动的变化。假手术组在术后2 h取材，脑梗死各时间组在梗死后的相应时间点取材。另取40只大鼠随机分为空白对照组、生理盐水组（10 μL）、L-谷氨酸组（0.5 μmol，10 μL）、MK-801（4 nmol，10 μL）预处理后再侧脑室注射L-谷氨酸组和MK-801预处理后再MCAO组，每组8只，分别在侧脑室注射后或术后30 min取材，以观察脑梗死诱发心律失常中谷氨酸的作用。每项实验前大鼠均监测心电20 min，心电图正常者用于实验。

1.5 脑梗死动物模型的制备和鉴定

脑梗死动物模型的制备方法同前期发表文章[7-9]，基本过程为：水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，颈部正中纵行切口，游离右侧颈总、颈内和颈外动脉，结扎颈外动脉，暂时夹闭颈内动脉，颈总动脉开一小口，将栓线向头侧插入，经颈内动脉进入大脑中动脉，进线长度（17.5±0.5）mm，形成大脑中动脉栓塞。假手术组栓线插至大脑中动脉起始处撤回，余同模型组。模型的鉴定采用TTC染色和神经功能学评分[10-11]，TTC染色梗死区明显且神经功能学评分大于2分者造模成功。

1.6 Western Blot检测

脑组织入组织裂解液研磨，匀浆液4℃ 1000 r/min离心15 min，取上清，测蛋白浓度，上样，电泳分离（10%聚丙烯酰胺凝胶），转膜（聚偏二氟乙烯膜），37℃封闭（3%牛血清白蛋白）1 h，洗膜，加一抗（1∶500）4℃孵育过夜，洗膜，加二抗（1∶1000）孵育1 h，洗膜，BCIP/NBT显色。GAPDH作内参，结果用Alphaview 3.1.1.0软件分析。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（LSD-t法），两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠大脑中动脉栓塞后心电图变化

假手术组心律失常发生率为0，脑梗死组心律失常的发生率为78.75%，明显高于假手术组（P < 0.01），且MCAO后大鼠会出现2次心律失常，分别在MCAO后30 min和4 h左右。空白对照组和生理盐水组心律失常发生率均为0，L-谷氨酸组心律失常发生率为87.5%，明显高于空白对照组（P < 0.01）。MK-801预处理20 min心律失常发生率为0，MK-801预处理20 min后再侧脑室注射L-谷氨酸组或MCAO心律失常的发生率均为0。

2.2 大鼠大脑中动脉栓塞后杏仁核活动的改变

与假手术组比较，大鼠大脑中动脉栓塞后杏仁核神经元Fos蛋白的表达在造模后30 min和4 h明显增加，差异有统计学意义（P < 0.01），与MCAO后心律失常发生时间点相对应。见图1。

2.3 大鼠大脑中动脉栓塞后杏仁核活动改变的谷氨酸能机制

与空白对照组比较，生理盐水组杏仁核神经元Fos蛋白表达的变化差异无统计学意义（P > 0.05），L-谷氨酸组杏仁核神经元Fos蛋白表达明显增加（P < 0.05），MK-801预处理后给予L-谷氨酸或MCAO后Fos蛋白表达无明显变化（P > 0.05）。见图2。

3 讨论

脑梗死合并心律失常是脑梗死猝死的主要原因之一，严重威胁着人类的健康。本研究发现，MCAO可诱发心律失常的发生，与临床报道一致[1]，但MCAO后心律失常的发生率偏高于临床，可能与实验动物模型脑缺血程度相对均一有关。越来越多的临床和实验证明，心律失常的发生除与心脏自身的病变有关外，还与中枢神经系统的功能状态密切相关。脑梗死可破坏中枢神经系统的完整性，进而导致自主神经系统活动异常[12]，特别是交感神经过度激活，与致命性心律失常的发生密切相关[13]。杏仁核是前脑内参与自主神经系统和心血管功能活动整合中枢之一[4]，杏仁核受损时，心电图会发生明显改变[5]，通过刺激杏仁核可建立交感源性心律失常动物模型[6]。