壮骨止痛方对去卵巢骨质疏松大鼠CGRP及β2—AR的影响

甘国兴 刘毓 李劲平 张国民 易仲媛

[摘要] 目的 探讨壮骨止痛方对去卵巢骨质疏松大鼠血清降钙素基因相关肽（CGRP）及骨组织β2-AR表达的影响。 方法 72只SPF级雌性SD大鼠随机选出12只，摘除卵巢周围相应质量脂肪后作为假手术组。其余60只采用双侧去卵巢法制备骨质疏松病理模型，随机分为模型组、壮骨止痛方高剂量组（13.2 g/kg）、中剂量组（6.6 g/kg）、低剂量组（3.3 g/kg）和戊酸雌二醇组（2.1×10-5 g/kg），每组各12只。模型组及假手术组给予等体积纯净水，均干预13周。采用ELISA法检测血清CGRP含量，免疫组化法检测骨组织β2-AR蛋白表达。 结果 与假手术组比较，模型组大鼠血清CGRP含量显著减少，骨组织β2-AR蛋白表达显著下调，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。与模型组比较，戊酸雌二醇组及壮骨止痛方各剂量组大鼠血清CGRP含量显著增加，骨组织β2-AR蛋白表达上调，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。壮骨止痛方不同剂量组组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 壮骨止痛方能够促进去卵巢骨质疏松模型大鼠CGRP表达，上调骨组织β2-AR蛋白表达，这可能是其抗骨质疏松的作用机制之一。

[关键词] 骨质疏松；壮骨止痛方；降钙素基因相关肽；β2型肾上腺素能受体

[中图分类号] R259 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）03（a）-0009-04

[Abstract] Objective To explore the effect of Zhuanggu Zhitong prescription on the CGRP and β2-AR in ovariectomized osteoporosis rats and investigate its mechanism in anti-osteoporosis. Method 72 rats were randomly divided into sham operation group （12 cases） and model group （60 cases）， the model group rats were ovariectomized osteoporosis and the sham operation group rats were excised equal weight fat. After the modeling， the rats were randomly divided into model group， Zhuanggu Zhitong prescription high-dose group （13.2 g/kg）， middle-dose group （6.6 g/kg）， low-dose group （3.3 g/kg） and estradiol valerate group （2.1×10-5 g/kg）， with 12 rats in each group. The model group and sham operation group rats were given equal volume water. All intervened for 13 weeks. The content of CGRP in serum was detected by ELISA and protein expression of β2-AR in bone tissue were detected by immunohistochemistry. Results Compared with sham operation group， the content of CGRP in serum and protein expression of β2-AR in bone tissue of model group were significantly declined， with high statistically significant differences （all P < 0.01）. Compared with the model group， the content of CGRP in serum and protein expression of β2-AR in bone tissue of different doses Zhuanggu Zhitong prescription group and estradiol valerate group were increased significantly， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. There were no significant differences in different doses of Zhuanggu Zhitong prescription groups （P > 0.05）. Conclusion Zhuanggu Zhitong prescription can promote the secretion of CGRP and protein expression of β2-AR， which may be one mechanism of ZhuangguZhitong prescription to anti-osteoporosis.

[Key words] Osteoporosis； Zhuanggu Zhitong prescription； CGRP； β2-AR

壯骨止痛方对骨质疏松症具有很好的疗效[1]。骨保护蛋白（osteoprotegerin，OPG）/核因子-κβ受体活化因子（receptor activator of nuclear factor kappa β，RANK）/核因子κβ受体活化因子配体（ligand of receptor activator of nuclear factor kappa β，RANKL）信号通路在骨代谢中具有重要作用，是影响破骨细胞生成和调节其功能最重要的途径，通过调节OPG/RANKL平衡，可以影响信号通路下游因子进而影响破骨细胞的增值和凋亡[2]。研究发现，壮骨止痛方能够上调去卵巢骨质疏松模型大鼠血清及骨组织OPG表达，下调RANKL表达，提高OPG/RANKL比值[3]，但壮骨止痛方如何调节OPG/RANKL平衡目前尚未明确。研究发现，交感神经系统通过与成骨细胞和破骨细胞上的肾上腺素受体结合对骨量进行调节，肾上腺素能可以调节OPG和RANKL的表达[4]。降钙素基因相关肽（calctionin gene-related peptide，CGRP）通过与其受体结合，调节成骨细胞和破骨细胞功能，参与骨的生长、修复和重建[5]。本文从调节CGRP和β2-AR的角度探讨壮骨止痛方抗绝经后骨质疏松的作用机制。

1 对象与方法

1.1 一般资料

1.1.1 动物 200 g左右3月龄SPF级SD雌性大鼠72只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物质量合格证号NO.43004700005517。标准普通饲料喂养。饲养于中南大学湘雅三医院动物实验中心清洁动物房，室温23～25℃，相对湿度50%～70%。

1.1.2 药物及试剂 壮骨止痛方（包括补骨脂、女贞子、淫羊藿、骨碎补、枸杞子等7味中药）药材购自长沙九芝堂股份有限公司，由中南大学药学院李劲平教授鉴定并制备。戊酸雌二醇片（拜耳医药保健有限公司广州分公司，生产批号：J20130009），CGRP ELISA检测试剂盒（上海邦奕生物科技有限公司），β2-AR免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.1.3 主要仪器 酶标仪（BioTek，USA），HHS-2电子恒温不锈钢水浴锅（上海南阳仪器有限公司），LEICA DMLB2 型双目显微镜（德国LEICA公司），MIAS型医学图像分析系统（北航公司），Shandon325型石蜡切片机（英国Shandon公司），DNP-9162型电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司），Motic B5型显微摄像系统（麦克奥迪实业集团公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模及给药 按照参考文献[3]方法，按体重指数随机选出12只大鼠，摘除卵巢周围相应质量的脂肪作为假手术组，其余60只大鼠采用双侧去卵巢法制备骨质疏松病理模型，按体重随机分为模型组、壮骨止痛方高剂量组（13.2 g/kg）、中剂量组（6.6 g/kg）、低剂量组（3.3 g/kg）和戊酸雌二醇组（2.1×10-5 g/kg），每组各12只。分组后，除模型组及假手术组给予等体积纯净水外，其余各组大鼠灌胃给予相应药物，均干预13周，剂量按人鼠体表面积换算。

1.2.2 血清CGRP含量检测 给药干预结束后，大鼠用10%水合氯醛麻醉后采血，静置2 h，3500 r/min离心15 min，取上清液采用ELISA法按试剂盒说明书检测血清CGRP含量。

1.2.3 骨组织β2-AR蛋白表达检测 参照文献[3]采用免疫组化法（SABC法）检测骨组织β2-AR蛋白表达。以棕黄色或棕褐色为阳性，采用北航MIAS医学图像分析系统进行分析。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，数据符合正态性及方差齐性，采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验；数据不符合正态性或方差齐性，则用秩和检验进行统计分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对大鼠血清CGRP和骨组织β2-AR的影响

与假手术组比较，模型组大鼠血清CGRP含量显著下降，骨组织β2-AR蛋白表达显著下调，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与模型组比较，戊酸雌二醇组大鼠血清CGRP含量显著增加，骨组织β2-AR蛋白表达显著增加，差異均有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）。壮骨止痛方干预后，与模型组比较，各剂量组大鼠血清CGRP含量均显著增加，骨组织β2-AR蛋白表达增加，差异均有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）；壮骨止痛方不同剂量组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1，图1（封三）。

3 讨论

壮骨止痛方由补骨脂、淫羊藿、枸杞子、川牛膝等7味药物组成，既着重补肾气、温肾阳，兼顾滋补肝肾阴精，同时加用通经化瘀活络之品，具有补益肝肾、强筋骨的作用，对绝经后骨质疏松症具有确切疗效[1]。壮骨止痛方能够通过调节骨质疏松模型大鼠OPG/RANKL平衡发挥抗骨质疏松作用[4]，但是具体作用环节尚未清楚。研究发现[4]交感神经系统可能是通过激活成骨细胞上的β2-AR进而激活破骨细胞分化因子RANKL来间接发挥对破骨细胞功能的调节作用，CGRP能够调节OPG、RANKL表达量的相对比值发挥抗骨质疏松作用。因此，研究壮骨止痛方对骨质疏松模型大鼠CGRP和β2-AR的影响，可以阐明其调节OPG/RANKL平衡的具体作用环节。

CGRP通过与成骨细胞和破骨细胞上的受体结合，调节成骨细胞和破骨细胞功能，参与调节骨的生长、修复及改建[5]。梁伟[6]研究发现，适当浓度的降钙素基因相关肽可以促进骨质疏松大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化，且呈剂量依赖性。杨亚东等[7]研究表明，CGRP能够调节OPG、RANKL表达量的相对比值，间接地参与骨折愈合过程的调节。陈光华等[8]等研究发现，CGRP能够经调节OPG/RANKL比值，进而调控骨的吸收与形成。去卵巢骨质疏松模型大鼠血清CGRP含量明显降低，骨组织CGRP及其受体蛋白表达下调，药物干预后血清及骨组织CGRP显著增加，骨密度增加[9-10]。本研究中去卵巢骨质疏松模型大鼠血清CGRP蛋白表达下调，结果与文献报道一致。

越来越多的研究表明，交感神经系统能够调节成骨细胞和破骨细胞功能，在骨量的调控中起关键作用[11-14]。交感神经系统可能是通过激活成骨细胞上的β2-AR进而激活破骨细胞分化因子RANKL来间接发挥作用的[15]。动物实验研究表明，激活实验鼠β2-AR可导致其成骨细胞数量、骨形成率和骨量减少；而抑制β2-AR则可明显提高大鼠成骨细胞数量、骨矿物沉积率和骨量[16]。体外研究表明，激活成骨细胞上的β2-AR可抑制c-MYC基因的表达，进而抑制成骨细胞的增殖和骨形成[17]。激活骨髓基质干细胞上的β2-AR，可以激活PKA信号转导通路抑制骨髓基质干细胞成骨分化和骨形成[18]。研究发现，去卵巢骨质疏松模型大鼠骨组织β2-AR表达升高，骨碎补总黄酮可以降低模型大鼠骨组织β2-AR表达，发挥抗骨质疏松作用[19]。本研究中去卵巢骨质疏松模型大鼠骨组织β2-AR表达降低，结果与文献报道相反[19]，其原因尚未清楚，需要进一步深入研究阐明。

前期研究发现，去卵巢骨质疏松模型大鼠血清及骨组织RANKL表达显著增加，OPG表达显著下调，OPG/RANKL比值减少，壮骨止痛方能够显著降低模型大鼠血清及骨组织RANKL表达，上调OPG表达，提高OPG/RANKL比值[3，20]。本研究中，去卵巢骨质疏松模型大鼠血清CGRP含量显著下降，骨组织β2-AR蛋白表达显著下调；壮骨止痛方干预后，各剂量组大鼠血清CGRP含量显著增加，骨组织β2-AR蛋白表达显著上调；壮骨止痛方不同剂量组间比较差异无统计学意义。推测壮骨止痛方可能通过调节去卵巢骨质疏松模型大鼠CGRP及β2-AR表达，作用于OPG/RANKL/RANK信号通路，发挥抗骨质疏松作用，其具体作用环节还需进一步深入研究。

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