高效液相色谱-二极管阵列检测法同时测定二冬宁脑丸中橙皮苷、芍药苷及阿魏酸含量

张桂平，杨荣波，王平晟

（1.河南省南阳市食品药品检验所，河南 南阳 473000； 2.河北省南阳市中医院，河南 南阳 473000）

二冬宁脑丸由天冬、麦冬、地龙、僵蚕、珍珠母、陈皮、赤芍、川芎等14味药材组方，具有滋阴潜阳、化痰祛瘀功效，临床主要用于治疗阴虚阳亢痰瘀互结所致半身不遂、口眼歪斜、言语蹇涩或不语、感觉减退或消失等症。方中陈皮主要成分为橙皮苷，具有理气健脾、燥湿化痰等功效[1]；赤芍主要成分为芍药苷，具有保肝、抗肿瘤、神经保护、心脏保护、抗血栓、抗氧化、抗内毒素等多种药理作用[2]；川芎主要成分为阿魏酸，有抗血小板凝集、抗血栓、抗菌、消炎、抗肿瘤、抗突变、增加免疫力等功效[3]。本试验中采用高效液相色谱-二极管阵列检测（HPLC-PDA）法同时测定二冬宁脑丸中橙皮苷、芍药苷和阿魏酸含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A型高效液相色谱仪，包括SPD-M20A检测器（日本Shimadzu公司）；XS205型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；SK5200H型超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 试药

二冬宁脑丸（南阳市中医院，批号分别为20161117，20170103，20170225，20171017，20171220，20180123，规格为每瓶 30 g）；橙皮苷对照品（批号为 110721-201617，含量96.1%），芍药苷对照品（批号为110736-201741，含量95.7%），阿魏酸对照品（批号为110773-201614，含量99.0%），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Welch Materials C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相:甲醇（A）-1% 乙酸溶液（B），梯度洗脱（0～15 min时 30%A，15～40 min时 30%A→35%A，40～42 min时 35%A→30%A，42～45 min时 30%A）；流速:1.0 mL ／min；检测波长:284 nm（橙皮苷），230 nm（芍药苷），321nm（阿魏酸）；柱温:35℃；进样量:10μL。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液:取阿魏酸对照品13.46 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解并定容，摇匀，得对照品溶液Ⅰ；取橙皮苷对照品52.34 mg和芍药苷对照品14.54 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加入对照品溶液Ⅰ10mL溶解，并加入70%乙醇定容，摇匀，得每 1 mL 含橙皮苷 0.5030 mg、芍药苷 0.1391 mg、阿魏酸0.01333 mg的混合对照品贮备液，取4 mL，置10 mL容量瓶中，加70%乙醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液。

供试品溶液:取样品适量，研细，混匀，精密称定1.5 g，置具塞锥形瓶中，加70%乙醇25 mL，称定质量，浸泡过夜后，超声（功率250W，频率40kHz）处理30 min，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

阴性对照溶液:按二冬宁脑丸处方和工艺分别制备缺陈皮、赤芍、川芎的阴性样品，分别制备阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验:取上述对照品溶液、供试品溶液各适量，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。理论板数按橙皮苷、芍药苷及阿魏酸峰计均应不低于3000，分离度均大于1.5，基线分离良好。

专属性试验:取对照品溶液、阴性对照溶液各适量，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。阴性对照溶液在与橙皮苷、芍药苷、阿魏酸对照品溶液相同保留时间处无干扰峰，表明专属性良好。

线性关系考察:分别精密量取混合对照品贮备液0.8，1.5，2.5，4.0，6.0，8.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加70%乙醇定容，摇匀，制成系列混合对照品溶液。量取10 μL，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（，μg／mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得橙皮苷、芍药苷、阿魏酸回归方程分别为Y=18181+70935（r=0.9997，n=6）、Y=12538X+ 8370.5（r=0.9995，n=6）、Y=67272-3143（r=0.9994，n=6）。结果表明，橙皮苷、芍药苷、阿魏酸质量浓度在 40.24 ～402.40 μg／mL、11.128 ～ 111.280 μg ／mL、1.066 ～ 10.664 μg ／mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:取混合对照品溶液适量，按拟订色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果橙皮苷、芍药苷、阿魏酸峰面积的RSD分别为 0.52%，0.74%，0.81%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液（批号为20170225）适量，分别于室温下放置 0，2，4，8，12，24 h 时按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果橙皮苷、芍药苷、阿魏酸峰面积的RSD分别为 0.68%，1.24%，1.37%（n=6），表明供试品溶液室温放置24 h内基本稳定。

重复性试验:取样品（批号为20170225）6份，精密称定，依法制备供试品溶液，再按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果橙皮苷、芍药苷、阿魏酸平均含量分别为 3.214，0.819，0.080 mg／g，RSD分别为0.71%，0.95%，1.16%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验:取已知含量样品（批号为20170225）适量，共6份，分别加入一定质量浓度的混合对照品溶液，依法制备供试品溶液，再按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果见表1。

图1 高效液相色谱图

表1 加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

取6批样品各适量，依法制备供试品溶液，再按拟订色谱条件进样测定，每批平行测定3次，取平均值，记录峰面积并计算样品含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（mg／g，n=3）

3 讨论

检测波长选择:取3种对照品进行全波长扫描，结果橙皮苷、芍药苷和阿魏酸分别在284，230，321 nm波长处有最大吸收，故本试验中在不同波长处测定3种成分，结果稳定。

流动相选择:采用不同比例的甲醇-0.05%磷酸溶液、甲醇-0.05 moL／L磷酸二氢钾溶液、甲醇-1%乙酸溶液[4-5]、乙腈-1%乙酸溶液[6-8]作流动相进行比较，结果采用甲醇-1%乙酸溶液梯度洗脱时，各待测成分色谱峰峰形良好，分离度均大于1.5%，且阴性对照无干扰。

提取溶剂选择:使用不同比例的甲醇和乙醇冷浸过夜后超声30，60 min进行提取，结果发现，以70%乙醇为提取溶剂，冷浸过夜后超声30 min，芍药苷提取效率比以甲醇为提取溶剂时稍降低，但橙皮苷和阿魏酸提取效率最高，且干扰最少。

综上所述，本研究中建立的方法操作简便、准确，精密度、稳定性、重复性均较好，可用于同时测定二冬宁脑丸中橙皮苷、芍药苷和阿魏酸的含量。