60Co-γ辐照对丹香清脂颗粒中5种有效成分含量的影响

康江丽，吴 雯

（中国人民解放军联勤保障部队第900医院，福建 福州 350000）

丹香清脂颗粒是由丹参、川芎、桃仁、降香、大黄等8味中药材组方的中药复方制剂，属国家基本药物，收载于2015年版《中国药典（一部）》，有活血化瘀、行气通络功效，临床主要用于治疗高脂血症属气滞血瘀证者[1]。丹参和川芎为方中君药，有活血、化瘀、活络功效，丹参主要成分有丹参酮ⅡA和丹酚酸B[2-3]，川芎主要成分为藁本内酯、洋川芎内酯A和洋川芎内酯I等[4-5]。该颗粒现行法定标准中仅有川芎、大黄和莪术的薄层色谱鉴别项及丹参酮ⅡA的含量测定项，用于其质量控制稍显不足。

丹香清脂颗粒制作工艺复杂，为保证制剂成品质量，避免在加工和储存过程中受到细菌污染，须采取灭菌措施。60Co-γ辐照灭菌法是以γ射线电离辐射产生的高能射线，通过物理和生物效应，破坏细菌中蛋白质的合成，从而达到杀菌效果，穿透力强、操作简单、灭菌效果好，可在常温下进行[6-7]。本研究中采用60Co-γ辐照丹香清脂颗粒进行灭菌，并建立高效液相色谱（HPLC）法同时测定丹香清脂颗粒中丹参酮ⅡA、丹酚酸B、藁本内酯、洋川芎内酯A和洋川芎内酯I的含量，分别考察2，5，8 kGy 3个辐照剂量对上述成分含量的影响，确定最佳有效辐照强度，为丹香清脂颗粒生产工艺中的灭菌提供参考。现报道如下。

图1 高效液相色谱图

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪，包括G1311A四元梯度泵、G1329A自动进样器、G1314B-DAD检测器、G1316A柱温箱、Agilent-Chemistation数据处理系统（美国Agilent公司）；AUW-220D型电子分析天平（日本Shimadzu公司）；中药粉碎机（浙江屹立工贸有限公司）；60Co-γ辐照装置（深圳市金鹏源辐照技术有限公司）；KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；LRH-150B型生化培养箱（广东省医疗器械厂）；ZOZ-AB型电热恒温干燥箱（上海跃进医疗器械厂）；YJ-875型医用净化工作台（苏州净化设备厂）。

1.2 试药

丹香清脂颗粒（吉林敖东集团大连药业股份有限公司，批号分别为 170915，171209，180123，180217，180321，180511，180622，规格为每袋 10 g）；丹参酮ⅡA对照品（批号为110766-201721，含量 99.5%）、丹酚酸B对照品（批号为 111562-201716，含量 94.1%）、藁本内酯对照品（批号为111737-201608，含量 100.0%），均购于中国食品药品检定研究院；洋川芎内酯A对照品（批号为62006-39-7，含量97.2%），洋川芎内酯I对照品（批号为94596-29-5，含量97.5%），均购于上海纯优生物科技有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent Zorbax-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相:乙腈（A）-0.5% 磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～10 min时 42%A，10～25 min时 42%A→68%A，25～40 min时 68%A→88%A，40～50 min时 88%A→42%A）；流速:1.0 mL ／min；检测波长:280 nm（0 ～39 min），268 nm（40 ～50 min）；柱温:30 ℃[8-9]。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液:分别称取各待测成分对照品适量，精密称定，分别加80%甲醇制成每1 mL含丹参酮ⅡA1.2244 mg、丹酚酸 B 1.5125 mg、藁本内酯 0.6537 mg、洋川芎内酯A 0.5963 mg、洋川芎内酯I 0.4127 mg的混合对照品溶液，摇匀，低温避光贮存。

供试品溶液:取装量差异项下样品，研匀，取约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）45 min，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

阴性对照溶液:按丹香清脂颗粒处方和工艺制备缺丹参、川芎的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验:取上述混合对照品溶液、供试品溶液各适量，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。理论板数按各待测成分峰计均大于3000，分离度均大于1.5，基线分离良好。

线性关系考察:精密量取混合对照品溶液5 mL，置50 mL容量瓶中，加80%甲醇定容，精密量取1，2，5，10，15，20，25 μL，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分进样量（，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程与线性范围。详见表1。

表1 回归方程、线性范围及定量限（n=7）

定量限考察:分别精密量取混合对照品溶液适量，倍比稀释，按拟订色谱条件进样测定，以信噪比（S／N）10∶1计算定量限。结果见表1。

精密度试验:取混合对照品溶液适量，按拟订色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果丹参酮ⅡA、丹酚酸B、藁本内酯、洋川芎内酯A和洋川芎内酯I峰面积的RSD分别为 1.21% ，1.03% ，1.12% ，0.82% ，0.89%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取供试品（批号为180321）溶液适量，分别于室温下放置 0，3，6，9，12，18，24 h 时按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果丹参酮ⅡA、丹酚酸B、藁本内酯、洋川芎内酯 A和洋川芎内酯 I峰面积的RSD分别为 1.13% ，0.90% ，1.02% ，0.83% ，0.71%（n=7），表明供试品溶液室温放置24 h内基本稳定。

重复性试验:精密称取样品（批号为180321）6份，依法制备供试品溶液，再按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果丹参酮ⅡA、丹酚酸B、藁本内酯、洋川芎内酯 A和洋川芎内酯 I平均含量分别为1.1048，1.3622，0.2413，0.1927，0.1035 mg ／g，RSD分别为 1.31% ，1.01% ，1.10% ，0.84% ，0.91%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验:取已知含量的样品（批号为180321）适量，共6份，分别加入低、中、高质量浓度的待测成分对照品溶液，依法制备供试品溶液，再按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

取7批样品各适量，分别以2，5，8 kGy剂量60Co-γ辐照，依法制备供试品溶液，再按拟订色谱条件进样测定，平行3次，记录峰面积并计算样品含量。数据以SPSS 19.0统计学软件分析，行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。结果见表3。

表3 样品含量测定结果（mg／g，n=6）

3 讨论

藁本内酯、洋川芎内酯A和洋川芎内酯I属苯酞类成分，易受氧化、水解、光解、异构化等影响发生结构改变。藁本内酯的化学结构为不饱和的苯酞结构，3位上有活泼的丁烯基，均为化学不稳定性因素[10]；洋川芎内酯A含有的不饱和环易通过脱氢反应形成更加稳定的苯环结构[11]。

本试验中取供试品溶液及各对照品溶液进行全波长扫描，结果显示，丹参酮ⅡA、丹酚酸B在268 nm波长处有最大吸收，藁本内酯、川芎内酯A和川芎内酯I在280 nm波长处有最大吸收，故选择2个波长进行测定。在流动相的选择中，分别尝试了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-冰醋酸溶液、乙腈-磷酸溶液4种不同体系。最后发现，以乙腈-0.5%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱时，各色谱峰之间分离良好，杂质峰无干扰。提取方法考察了回流提取、超声提取，考虑到超声提取简单方便且提取完全，故选用超声提取法，并通过比较不同提取溶剂体积及不同提取时间下超声提取法对5种成分的提取率，最终确定为用80%甲醇作溶剂超声提取45 min。本试验中通过考察60Co-γ辐照对丹香清脂颗粒中5种有效成分含量的影响，发现辐照剂量控制在不超过5 kGy时，能对丹香清脂颗粒进行有效消毒灭菌，同时不影响制剂质量。该结论可为对该类药物进行60Co-γ辐照灭菌提供参考。