牛蒡根总黄酮对高尿酸血症小鼠的影响

王 露，权利娜，赵 博，赵子强

(陕西中医药大学 药学院, 陕西 咸阳 712046)

高尿酸血症(HUA)[1]是由嘌呤代谢紊乱导致的尿酸[2]排泄减少(或增加)的代谢性疾病。目前,用于治疗高尿酸的药物主要分为抑制尿酸生成[3]、黄嘌呤氧化酶抑制剂[4]和促进肾脏尿酸排泄药物。但它们对胃肠道和肾脏都有较大的副作用,因此寻找治疗高尿酸血症和其肾损伤的天然药物[5]具有重要的意义。本实验采用酵母浸膏和氧嗪酸钾盐法联合[6]建立小鼠高尿酸血症模型[7],观察牛蒡根总黄酮对HUA小鼠血清肌酐(CREA)、尿素(UR)、尿酸(UA)水平以及小鼠肾脏病理状态下的影响[8],为牛蒡根防治HUA提供实验依据。

1 材 料

1.1 实验动物

昆明种6周龄小鼠,雄性,体重30±2g(西安交通大学医学部实验动物中心提供) 合格证号: SCXK(陕)2012-003。

将该实验中的小鼠保持在湿度为40～70%且温度为20～24℃的正常环境中。在实验之前,将小鼠在实验室中适应环境一周;整个实验过程中,小鼠均是自由饮水和块状鼠饲料。

1.2 药品及试剂

牛蒡根(陕西康盛堂药业有限公司,批号140506);酵母浸膏(北京奥博兴生物技术有限责任公司,批号20141122);羧甲基纤维素纳(天津市天力化学试剂制造有限公司,批号140661-1201406);别嘌醇片(上海信谊万象药业股份有限公司,批号20146002);氧嗪酸钾盐(上海源叶生物科技有限公司公司,批号20150103);0.9%氯化钠注射液(辰欣药业股份有限公司公司,批号20150302);无水乙醇(批号100092683)、二甲苯(批号10023418)、中性树胶(批号10004160)均为国药集团化学试剂有限公司。HE染液(批号G1005)、分化液(批号G1005-3)、返蓝液(批号G1005-4)均为servicebio产品。肌酐(CREA)检测试剂盒(批号141016006)、尿酸(UA)检测试剂盒(批号141215203)、尿素(UREA)检测试剂盒(批号141316004)是深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司产品。其他未做说明试剂均为国内生产的分析级。

1.3 实验仪器

电子分析天平(上海佑科仪器有限公司FR2004B)、高速台式离心机(赛默飞世尔科技公司SORVALL)、全自动生化分析仪(迈瑞医疗国际有限公司BS-330E)、脱水机(武汉俊杰电子有限公司产品JJ-12J)、包埋机(武汉俊杰电子有限公司产品JB-P5)、冻台(武汉俊杰电子有限公司产品JB-L5)、病理切片机(上海徕卡仪器有限公司RM2016)、组织吊具(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司KD-P)、正置光学显微镜成像系统(日本尼康NikonEclipse E100 Nikon DS-U3)。

2 实验方法

2.1 牛蒡根总黄酮的提取工艺

用石油醚对牛蒡根药材进行脱脂处理,再用70%乙醇加热回流提取3h(投料比为1∶8),趁热过滤,弃去药渣,抽滤,滤液用旋转蒸发仪回收乙醇,浓缩至几乎无醇味时,水浴加热挥掉剩余水分,冷冻干燥成粗粉[9]。用LS-46D大孔树脂进行纯化,纯化后继续冷冻干燥成粉末待用。以芦丁为对照品,用紫外可见分光光度计测定对照品的吸光度,得到标准曲线的回归方程为Y=6.8823X+0.007,最后经过计算得到纯化后总黄酮的含量为89.1%。将制备的牛蒡根纯化产物[10]和制备好的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液按高、中、低剂量组配置成灌胃药液[11]。

2.2 造模方法

取小鼠30±2g,72只随机分为6组,分别为:空白组、模型组、牛蒡根总黄酮高剂量组(560 mg/kg)、牛蒡根总黄酮中剂量组(280 mg/kg)、牛蒡根总黄酮的低剂量组(140mg/kg)、别嘌呤醇片剂组(50 mg/kg)。在实验室中使实验小鼠适应环境一周后,给其每天两次酵母浸膏(30g/kg/d)灌胃给药,连续13天,于第14天灌胃给药后再腹腔注射氧嗪酸钾盐(200 mg/kg)一次。分别在第1天,第8天,第14天分别称量动物体重一次。模型组与空白组相比(P<0.05)说明造模成功。在第8天,给药组和阳性对照组每天下午一次灌胃给药直至14 天,共给药7天。高剂量组560 mg/kg给药(给药体积0.2 mL/l0g);中剂量组(280 mg/kg),低剂量组(140mg/kg),别嘌醇片剂组50 mg/kg(给药体积0.2 mL/l0g);空白组和模型组给予相同剂量的蒸馏水。

2.3 检测方法

2.3.1 小鼠CREA，UR，UA含量的测定 在动物模型建立后第14d,腹腔注射氧嗪酸钾盐后1h后,进行摘眼球取血,并在低温下静置30 min后,通过以3 000 r/min,半径5cm低温离心分离血清,10 min后将分离的血清在自动生化分析仪上测定血清中UREA、CREA和UA的含量,根据制造商提供的说明书和仪器操作方法进行具体的操作。

2.3.2 小鼠肾脏状态的检查 小鼠取血后,进行颈脱位处死小鼠,用观察其肾脏组织变化情况,准备像素好的拍照设备进行记录。

2.3.3 小鼠肾脏组织切片的观察 解剖剪解剖小鼠,摘取肾脏,制作病理切片,进行石蜡切片脱蜡至水、苏木素染色、伊红染色、脱水封片,用显微镜观察肾脏组织切片的变化情况并选取适当的图像用于照片记录。

2.4 统计学处理方法

3 实验结果

3.1 小鼠一般生活状态观察

在整个实验过程中,空白组小鼠饮水进食正常,毛色鲜艳,大便正常,精神状态良好。模型组从第3天开始进食减少,实验过程中部分小鼠毛色发暗,在整个实验过程中出现6%左右的死亡率。与模型组相比,总黄酮高剂量灌胃组和阳性对照组的精神状态好,而中剂量组和低剂量组之间没有显着差异。

3.2 对模型小鼠体质量的影响

各组实验小鼠模型体质量测试结果,见表1。

表1 对酵母浸膏和氧嗪酸钾盐法建立HUA模型小鼠体质量的影响Tab.1 Effects of yeast extract and Potassium Oxalate Method on body weight of HUA mice( )

注:与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,ΔP<0.05。

由上表可看出,初始体质量基本无差异,在进行随机分组中各组体重分布均匀。

当实验进行一周时,与初始值相比,实验小鼠体重空白组增长较快,模型组有减重,其他各组体质量有所增加。在实验进行两周时,与空白组相比,模型组小鼠体质量显著减少(P<0.05)。与模型组相比,别嘌醇和高剂量组小鼠的体质量均增加(P<0.05),而中剂量和低剂量组均无明显差异(先用少量小鼠粗略的摸索中毒剂量或致死剂量,然后用中毒剂量或致死剂量的若干分之作为应用剂量,由于所用总黄酮为抗氧化成分,毒性十分小,结合溶解性,确定其给药剂量)。

3.3 对模型小鼠血清生化指标的影响

实验各组小鼠CREA、UR、UA活性水平测试结果,见表2和图1、图2、图3。

表2 对酵母浸膏和氧嗪酸钾盐法建立的HUA模型小鼠CREA，UR，UA水平的影响Tab.2 Effects of yeast extract and potassium oxalate on CREA, UR and UA levels in HUA model )

注:与空白组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,ΔP<0.05。

3.4 小鼠肾脏状态观察

图1可以看出,正常组的小鼠肾脏呈现正常肾脏的肉红色,见图1(a);模型组肾脏失去正常肾脏的肉红色,并出现区域性的白色,这可能是由于尿酸在肾脏中沉积引起的改变,见图1(b);高剂量组颜色上趋于正常组,见图1(c);阳性对照组颜色较模型组正常,见图1(d)。

图1 实验小鼠肾脏状态观察Fig.1 Observation of kidney status in experimental mice

由表2和图1可以看出,与空白组比较,模型组小鼠的CREA，UR，UA水平均显著升高(P<0.05),说明酵母浸膏和氧嗪酸钾盐法联合建立HUA模型组比,别嘌醇阳性组,牛蒡根总黄酮高剂量组均可显著降低小鼠CREA，UR，UA水平(P<0.05)。

3.5 小鼠肾组织切片观察

可以看出图2(e)空白对照组的肾脏结构正常,无炎性细胞浸润;在图2(a)模型组中观察到肾小管杂乱,淋巴细胞大量聚集,在肾小球周围出现炎性细胞浸润;图2(b)低剂量组可以看到淋巴细胞与模型组相比数量相对减少,但仍存在炎性细胞浸润现,并且肾小管排布散乱;图2(c)高剂量组相对模型组炎性细胞明显减少,基本未见炎性细胞浸润;图2(d)别嘌醇片组相对模型组炎性细胞减少,肾小管排列较为整齐。结果表明,牛蒡根总黄酮剂量组的病变较模型组病变程度轻。

图2 小鼠肾组织病理切片HE染色×200Fig.2 HE staining×200 in pathological sections of kidney of mice

4 讨 论

在该实验研究中,采用管饲的方法[12]来避免由饲料喂养不均匀引起的小鼠酵母浸膏摄入的差异[13]。在预实验中,每天使用酵母浸膏30 mg/kg,灌胃一次,14天后摘眼球取血,测得血清数值[14],但造模不成功。又进行小鼠HUA模型与酵母浸膏和氧嗪酸钾联合诱导[15]HUA模型[16]复制成功,模型组血清UA，UR和CR水平显着升高[17]。说明该模型可加快小鼠体内尿酸生成。持续灌胃酵母浸膏[18]对小鼠的肾脏有一定的损伤,发现有很多白色的星点,这可能就是尿酸盐[19]沉积物CR，UR排泄率减慢,这个有待在后续试验去进一步证实。从病理切片[20]可以发现牛蒡根总黄酮高剂量组相对于模型组病变程度小,从小鼠体重量[21]这个指标也可以看出模型组的小鼠体重量相比初始值减少,而高剂量组的体质量虽然增加缓慢,却也有不同程度的增加,说明高剂量可以对抗酵母浸膏和氧嗪酸钾盐法建立的小鼠HUA[22]。在对酵母浸膏和氧嗪酸钾盐法[23]建立HUA模型中,本实验选取中药有效部位进行针对性研究可以很好地提高牛蒡根在临床治疗UA水平[24],还可以降低CR，UR水平,说明牛蒡根总黄酮通过降低UA代谢途径中的关键酶活性调节UA水平,改善肾脏病理状态[25]。此前,虽有不少学者证实了有些中药具有防治高尿酸血症的功效,但临床应用中暂没有某一公开的中药被开发。本课题组在后续研究中,将进一步探索牛蒡根总黄酮降低HUA的作用机制[26]。因此,牛蒡根药材对于治疗高尿酸血症具有极大的潜力,但本实验对于其毒理学研究还需不断的探究,并进一步深化,从而为开发牛蒡根药用产品打好一定的基础。