干细胞因子抑制糖氧剥夺诱导的人脑微血管内皮细胞内质网应激性凋亡的研究

陈思莹 饶杰 卢晔芬 陈建军 程伟进 郑丽云

据统计，脑卒中年发病率高达1 287.3/10万，死亡率为126.4/10万，严重着威胁人们的健康[1]。在脑缺血、缺氧条件下，脑血管内皮细胞易发生损伤或坏死，再灌注损伤后往往导致脑缺血后二次损伤[2-3]。如何防治脑血管再灌注损伤是当前脑卒中的研究热点和难点[4]。干细胞因子（stem cell factor，SCF）与其酪氨酸激酶受体（c-Kit）构成SCF/c-Kit通路，参与细胞活性功能调节，对缺血、缺氧组织具有保护作用[5]。然而，目前关于脑血管缺血再灌注损伤的保护作用及其分子机制尚未完全明确。本研究就SCF对脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制作一探讨，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）抑制剂Compound C（S7306）、激活剂阿卡地新（AICAR）（S1802）购自美国塞莱克公司，SCF（S7901-10UG，≥97.0%）、噻唑蓝（MTT）购自美国Sigma公司，超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒、丙二醛（MDA）检测试剂盒及凋亡试剂盒购自中国上海碧云天生物技术有限公司；AMPK、磷酸化AMPK（p-AMPK）、蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）、C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白（CHOP）、断裂半胱氨酸蛋白酶-12（cleaved Caspase-12）、Bcl-2相关 X 蛋白（Bax）、B 细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）和β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体购自美国细胞信号技术（CST）公司。人脑微血管内皮细胞（h-BMEC）购自美国Scien Cell研究实验室。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将h-BMEC置于含10%FBS的杜尔伯科改良伊格尔培养基（DMEM，100U/ml青霉素+100μg/ml链霉素)，在 37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每2～3d更换新鲜培养基，待细胞融合80%时进行传代培养。

1.2.2 分组与建模 采用随机数字表法，将h-BMEC分为对照组、糖氧剥夺（OGD）组、SCF+OGD组（简称SCF组）、SCF+Compound C+OGD组（简称Comp C组）和SCF+AICAR+OGD组（简称AICAR组）。依据文献[6]的方法，建立细胞糖氧剥夺模型。待细胞融合达80%以上时，用PBS洗涤1次，加入无糖培养基，并将培养器皿置入OGD培养装置中，向内冲入混合气体（95%N2+5%CO2），持续6h；更换含20%FBS的高糖培养基。SCF组、Comp C 组、AICAR组分别予 300μmol/ml SCF、1μmol/L Compound C、1mmol/L AICAR处理OGD细胞；对照组在常规条件下置培养箱中培养。将各组置入37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养24h。

1.2.3 细胞存活率检测 采用MTT法。调整h-BMEC密度为2×104个/ml，接种于96孔培养板，待细胞融合达80%左右时，按上述分组方法进行实验，并设置调零孔，每组设置6个复孔。24h后，加入20μl MTT，37℃恒温箱孵育1～2h，弃培养基，加入二甲亚砜；以调零孔光密度值调零校准，使用酶联免疫检测仪在492nm波长处检测各孔吸光度值，计算细胞存活率。

1.2.4 细胞内SOD活性和MDA含量检测 分别采用水溶性四唑盐-8（WST-8）、硫代巴比妥酸（TBA）法进行检测。调整h-BMEC密度为2×105个/ml，接种于6孔板中，按上述分组方法进行实验。按照SOD活性检测试剂盒、MDA检测试剂盒说明书进行操作。上机检测，使用酶标仪分析细胞内SOD活性和MDA含量。

1.2.5 细胞凋亡率检测 采用膜联蛋白V/碘化丙啶（Annexin V/PI）双染法。0.25%胰酶消化并收集细胞，PBS洗涤细胞2次，使用500μl上样缓冲液重悬，依次加入 5μl Annexin V、5μl PI，室温下避光孵育 15min，上机检测，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.6 蛋白表达检测 采用Western blot法。调整h-BMEC密度为2×105个/ml，接种于6孔板中，按上述分组方法进行实验。24h后，加入放射免疫沉淀分析（RIPA）细胞裂解液冰上裂解15min，12 000r/min离心15min，吸取上清液，收集总蛋白。采用二喹啉甲酸(（BCA）法定量后，取20μg总蛋白用6%～10%聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳分离，电转至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，10%脱脂牛奶封闭10min。加入适当稀释度的一抗（AMPK、p-AMPK、PERK、CHOP、Caspase-12、Bax、Bcl-2、β-actin），4℃孵育，过夜；磷酸盐吐温缓冲液（PBST）洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗体，在室温下孵育1～2h，PBST洗涤；经化学发光试剂发光、显影和定影后，使用Image J软件分析条带的灰度值，即相对表达量。

1.3 统计学处理 应用SPSS 22.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组h-BMEC细胞存活率比较 OGD组、SCF组、Comp C组、AICAR组、对照组细胞存活率分别为（51.26±9.37）%、（88.23±6.68）%、（93.61±7.40）%、（55.11±8.65）%、（97.15±4.18）%。与对照组比较，OGD组、AICAR组细胞存活率均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与OGD组比较，SCF组、Comp C组细胞存活率均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与SCF组比较，AICAR组细胞存活率降低，差异有统计学意义（P＜0.05），而Comp C组细胞存活率差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 各组h-BMEC细胞内SOD活性和MDA含量比较 与对照组比较，OGD组、AICAR组SOD活性均降低，MDA含量均增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；SCF组、Comp C组SOD活性均增高，MDA含量均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与SCF组比较，AICAR组SOD活性降低，MDA含量增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 各组h-BMEC细胞内SOD活性和MDA含量比较

2.3 各组h-BMEC细胞凋亡率及Bax、Bcl-2表达比较 与对照组比较，OGD组、AICAR组Bcl-2表达均降低，细胞凋亡率、Bax表达、Bax/Bcl-2均增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与OGD组比较，SCF组、Comp C组Bcl-2表达均增高，细胞凋亡率、Bax表达、Bax/Bcl-2均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与SCF组比较，AICAR组Bcl-2表达降低，细胞凋亡率、Bax表达、Bax/Bcl-2均增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2和图1。

表2 h-BMEC细胞凋亡率及Bax、Bcl-2表达比较

图1 各组h-BMEC的Bax、Bcl-2表达的电泳图

2.4 各组h-BMEC内质网应激性凋亡相关蛋白表达比较 与对照组比较，OGD组、AICAR组PERK、CHOP、cleaved Caspase-12表达均增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与OGD组比较，SCF组、Comp C组PERK、CHOP、cleaved Caspase-12表达均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与SCF组比较，AICAR组PERK、CHOP、cleaved Caspase-12表达均增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3和图2。

表3 各组h-BMEC内质网应激性凋亡相关蛋白表达比较

图2 各组h-BMEC内质网应激性凋亡相关蛋白表达的电泳图

2.5 各组h-BMEC的p-AMPK、AMPK表达比较 与对照组比较，OGD组、AICAR组p-AMPK表达均增高，SCF组、Comp C组均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与OGD组比较，SCF组、Comp C组p-AMPK表达均降低，AICAR组增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与SCF组比较，AICAR组p-AMPK表达增高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4和图3。

表4 各组h-BMEC的p-AMPK、AMPK表达比较

图3 各组h-BMEC的p-AMPK、AMPK表达的电泳图

3 讨论

SCF与其c-Kit广泛分布于中枢神经系统，参与脑组织的发育和功能调节。SCF/c-Kit通过对中枢神经系统具有重要的保护作用。Dhandapani等[7]发现SCF可抑制谷氨酸神经毒性反应。Sun等[8]证实SCF可促进脑损伤局域神经修复。罗云等[9]证实缺血性损伤可增加SCF表达，降低脑细胞损害，提示SCF/c-Kit通路与缺血性损伤修复密切相关。本研究结果发现，与OGD组比较，SCF组细胞存活率明显增高，细胞凋亡率明显下降，Bax表达降低，Bcl-2表达增高，Bax/Bcl-2下降，而SOD活性增高，MDA含量降低；这说明SCF具有抑制OGD诱导h-BMEC损伤作用。本研究还发现，OGD细胞内CHOP、PERK、cleaved Caspase-12表达明显增高；这说明在OGD条件下，细胞启动了内质网应激性凋亡。与OGD组比较，SCF 组 CHOP、PERK、cleaved Caspase-12 表达明显降低，这说明SCF具有抑制OGD诱导内质网应激性凋亡的作用。

内质网应激性凋亡是指在应激状态持续或强化条件下，通过级联活化凋亡信号通路，促使细胞凋亡，其中CHOP是最经典的凋亡通路。CHOP接受PERK、质网核信号转导蛋白 a1（IRE1）、活化转录因子 6（ATF6）、活化转录因子4（ATF4）等分子激活后，转而促进Caspase-12活化或Bcl-2降解，从而启动细胞凋亡。有学者报道，内质网应激性凋亡途径受AMPK通路调控[10-11]。Yang等[10]证实，钼通过激活AMPK依赖的内质网应激诱导胰岛β细胞功能紊乱和凋亡。本研究结果发现，OGD组细胞内p-AMPK表达明显增高，而SCF组较OGD组明显降低；这说明SCF对AMPK的活化具有明显抑制作用。与SCF组比较，AICAR组细胞存活率差异无统计学意义，凋亡比例明显增高，Bax表达增高，Bcl-2表达降低，Bax/Bcl-2增高，SOD活性降低，MDA含量增高，CHOP、PERK、cleaved Caspase-12表达明显降低；Comp C组细胞存活率、细胞凋亡率以及 CHOP、PERK、cleaved Caspase-12表达差异均无统计学意义。以上结果说明OGD细胞中AMPK被活化，且AMPK介导SCF抵抗OGD诱导内质网应激性细胞凋亡作用。

综上所述，SCF对OGD诱导的h-BMEC损伤具有抑制作用，其分子机制与抑制AMPK介导的内质网应激性凋亡有关。