反复长波紫外线照射对人皮肤成纤维细胞DNA的损伤机制探讨

夏悦 赖维 刘玉芳 张杰 郑跃

中山大学附属第三医院皮肤科，广州 510630

皮肤慢性紫外线损伤（光老化）不仅影响容貌，还可造成皮肤完整性及免疫系统的损害，甚至可引发光线性肉芽肿等多种光相关疾病，严重者可导致基底细胞癌、鳞状细胞癌和恶性黑素瘤等皮肤肿瘤［1-2］。皮肤光老化的机制至今未明，紫外线对皮肤细胞的基因损伤在其发生机制中起重要作用。已有研究表明，DNA 损伤以及DNA 修复异常参与皮肤慢性光损伤的发生［3-5］，反复紫外线照射可以引起多种类型DNA 损伤，包括形成环丁烷嘧啶二聚体、胸腺嘧啶二聚体等［6-7］，是光源性皮肤肿瘤发生的物质基础。但长期反复长波紫外线（UVA）照射对人皮肤成纤维细胞DNA损伤修复及复制过程的影响目前仍不清楚，因此，我们对此进行研究。

材料与方法

一、材料

1.皮肤成纤维细胞：来自中山大学附属第三医院泌尿外科3例儿童包皮环切术后包皮组织，年龄5 ～7岁。本研究通过中山大学附属第三医院医学伦理委员会批准（批准号［2016］2-44），患儿家属均签署知情同意书。

2.试剂和仪器：DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、磷酸盐缓冲液（PBS）、青-链霉素（美国Gibco公司），细胞衰老半乳糖苷酶（SA-β-Gal）试剂盒（美国Cell signaling technology 公司），细胞凋亡试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。UVA照射仪（Sigma SS-03A，灯管为Philips UVATLl0RS，波长320 ～400 nm）和UVA照射计均产自上海希格玛高科技有限公司。RNA 逆转录试剂盒（日本TaKaRa 公司）、NanoPhotometer®分光光度计（美国IMPLEN 公司）、RNA 检测试剂盒（美国Agilent Technologies 公 司）、荧光定量仪 Qubit®3.0 Flurometer（美国Life Technologies 公司），二代测序RNA 文库制备试剂盒（英国NEB 公司）、PCR 试剂盒（英国QIAGEN 公司）、核酸纯化试剂盒（北京艾德科技有限公司）。

二、方法

1.原代皮肤成纤维细胞培养：取儿童包皮，参照文献［8］分离培养皮肤成纤维细胞，培养至第3 代冻存，取细胞复苏后10 代以内的细胞行后续实验。

2.建立皮肤成纤维细胞慢性光损伤模型：将3 ～6代成纤维细胞按1×106/皿接种于直径6 cm的细胞培养皿，待细胞长到70%融合时，弃培养液，PBS洗涤2次后，加2 ml PBS将细胞分为UVA组和对照组。。参照文献［8-10］，将UVA 组细胞置于UVA 辐照仪下，细胞距离光源15 cm，平均照射功率12.7 mW/cm2，单次照射时间为780 s，照射剂量为 9.9 J/cm2，照射结束后 PBS 洗涤 1 次，加入 2 ml DMEM培养基，每24 h照射1次，连续照射14 d。对照组细胞加入PBS后置于超净台避光，在DMEM培养基中培养14 d。

3.MTT法检测皮肤成纤维细胞增殖活性：将末次UVA照射后成纤维细胞按每孔5×103个接种于96孔培养板中，每组各设3个复孔。细胞培养24 h后，每孔加10 μl CCK8 试剂，37 ℃孵育4 h，在酶联免疫检测仪上测定450 nm 处吸光度（A值）。细胞活性（%）=（AUVA照射组-A空白孔）/（A对照组-A空白孔）×100%，实验重复3次，取均值。

4.β半乳糖苷酶染色检测细胞老化比率：末次UVA 照射后 48 h 去除DMEM培养基，PBS 洗 涤1次，按照试剂盒说明书检测两组细胞老化。显微镜下老化细胞胞质被染成蓝色，每皿至少计数500个细胞，计算阳性细胞所占百分比。实验重复3次，取均值。

5.流式细胞仪检测细胞凋亡率：末次UVA照射后，用胰蛋白酶消化细胞，调整细胞为1×106/ml。每组取1 ml细胞，预冷PBS洗涤3次后细胞重悬于200 μl结合缓冲液。加入10 μl异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V，避光反应20 min，冲洗固定后，加入0.5 ml 碘化丙锭染色，4 ℃反应30 min。加入300 μl 结合缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次，取均值。

6.表达基因谱分析：将UVA 组和对照组细胞分别使用RNA 逆转录试剂盒将全部基因完整转录为总RNA，使用NanoPhotometer®分光光度计检测样品的纯度和粗浓度，随后用荧光定量仪Qubit®3.0 Flurometer检测RNA样品准确浓度，RNA检测试剂盒检测RNA 样品完整性。检测合格后，对照组及UVA组各取0.5 ～5 μg总RNA，根据二代测序RNA 文库制备试剂盒的操作步骤，用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，随后将mRNA打断成短片段，以mRNA 为模板，用六碱基随机引物合成单链cDNA，然后合成双链cDNA，随后利用PCR 试剂盒纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA再进行末端修复、加尾并连接测序接头，用核酸纯化试剂盒回收目的基因片段后进行PCR 富集，获得cDNA文库。

cDNA 测序：先通过 qPCR，对 cDNA 的有效浓度进行准确定量（浓度＞10 nmol），随后使用HiSeq SR Cluster Kit v4-cBot-HS（Illumia）试剂在cBot上生成簇，之后用HiSeq 2500 测序平台对收集的cDNA样本进行测序。

KEGG差异表达富集分析：将对照组与UVA组的cDNA测序结果进行比较，对差异表达的基因通过基因组破译数据库（http：//www.kegg.jp/）进行京都基因与基因组百科全书分析（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG），对染色体的全部基因表达蛋白在细胞活动过程中的蛋白交互作用网络作出预测。然后对KEGG 中每个信号通路应用超几何检验进行富集分析，找出差异表达基因中显著富集的信号通路。

三、统计学方法

采用SPSS 22.0软件。两独立样本均数比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、皮肤成纤维细胞慢性光损伤模型的建立

UVA 组细胞体积变大，细胞内颗粒增多，出现慢性光损伤表型（图1），细胞活性明显低于对照组，细胞老化率和凋亡率均高于对照组（P＜0.05）。见表1。

二、关键酶差异表达基因检测

在 DNA 错配修复、DNA 复制和 DNA 碱基切除修复过程的关键酶中，UVA 组和对照组细胞之间出现表达差异的为DNA连接酶（Lig）1、核糖核酸酶H（RNaseH）2A 以及解旋酶Dna2，UVA 组上述基因表达水平均低于对照组（P＜0.01）。见表2。

图1 显微镜下观察反复长波紫外线（UVA）照射诱导皮肤成纤维细胞慢性光损伤（×100） UVA 组细胞与对照组相比体积变大，细胞内颗粒增多，出现慢性光损伤表型

表1 长波紫外线（UVA）反复照射对成纤维细胞活性、老化率、凋亡率的影响（，%）

表1 长波紫外线（UVA）反复照射对成纤维细胞活性、老化率、凋亡率的影响（，%）

注：n=3

UVA照射组对照组t值P值细胞凋亡率29.0±3.3 6.0±5.9 5.89＜0.05细胞活性72.0±5.2 96.0±3.7 6.51＜0.05细胞老化率79.7±5.2 6.4±0.8 24.12＜0.05

表2 长波紫外线（UVA）照射诱导皮肤成纤维细胞慢性光损伤过程中差异表达的DNA复制及修复关键酶基因

三、关键酶差异表达对皮肤成纤维细胞DNA修复的影响

KEGG分析显示，UVA诱导人皮肤成纤维细胞慢性光损伤后，在DNA 碱基修复过程，Lig 表达下调，导致 DNA 单碱基修复受阻，Lig 及 Lig1 表达下调导致DNA 多碱基修复过程受阻；在DNA 错配修复过程，由于Lig1 基因表达下调，即使DNA 内切酶、复制因子C（RFC）、错配修复酶（PMS2）、DNA错配切割酶（Mut）家族及其同源蛋白家族（MLH1、MLH2、MLH3、MLH6、PMS2）、DNA 复 制 蛋 白（RPA）、DNA 聚合酶（ExoI）表达无明显变化，修复过程亦受阻；在DNA 复制过程，RNaseH2A、Dna2、Lig1表达下调，复制过程受阻。

讨 论

引起皮肤光老化的机制复杂多样，主要涉及DNA 损伤、氧化应激、基质金属蛋白酶、炎症反应等方面。紫外线作用于皮肤表皮角质形成细胞，可引起细胞DNA 损伤，进而引发皮肤炎症、免疫抑制，严重时可导致皮肤肿瘤［11］。我们在2017年使用高通量测序方法，发现慢性紫外线照射人皮肤成纤维细胞，可引起607条基因表达改变，其中238条基因表达上调，369 条基因表达下调，这些表达改变的基因参与细胞的多种生物过程，包括细胞代谢、细胞内成分合成、细胞功能及信号通路［12］。本研究是在前期发现差异表达基因的基础上，研究慢性紫外线照射对人皮肤成纤维细胞DNA复制及修复过程的影响。

在哺乳动物细胞中，目前研究较多的DNA 修复通路包括核苷酸切除修复、碱基切除修复、重组修复和错配修复。机体的DNA 损伤修复系统可对损伤的DNA 进行修复来维持DNA 的完整性，修复失败或错误修复则可导致细胞凋亡以及可能导致肿瘤的发生。已有研究表明，DNA 损伤修复异常与多种皮肤病发生密切相关［13］。Yu 和 Lee［14］针对紫外线照射导致细胞活性氧的产生增加直接致DNA 损伤机制进行研究，并阐述了许多紫外线引起的症状与核苷酸切除修复密切相关。本研究显示，UVA 诱导人皮肤成纤维细胞慢性光损伤后，DNA 单碱基切除修复关键酶、DNA 错配修复关键酶以及DNA复制关键酶表达均出现改变。

Lig 参与多种DNA 修复，可独立完全修复部分DNA 单链断裂。我们研究发现，在UVA 反复刺激后，皮肤成纤维细胞的碱基切除修复、错配修复、DNA 复制过程中均出现Lig1 的表达下调，提示UVA 通过抑制Lig1 表达，影响细胞DNA 的修复过程及复制过程。

DNA解旋酶作用于DNA两条单链中间连接的碱基的氢键上，进而使两条单链在该处分开。RNaseH 是一种核糖核酸内切酶，能够特异性地水解杂交到DNA 链上的RNA 磷酸二酯键，故能分解RNA/DNA 杂交体系中的RNA 链。本研究显示，UVA 反复刺激皮肤成纤维细胞，主要通过抑制Lig1、RNaseH2A、Dna2 基因表达，影响细胞DNA 的正常复制过程，进而通过下游的生物学效应，引起细胞损伤及相关疾病发生。

近来一些新的研究表明，通过干预DNA 的损伤修复，可以预防紫外线诱发的皮肤光老化及相关皮肤病（包括皮肤肿瘤）［15］。Joo 等［16］证明，栝楼提取物通过调节BMAL1（brain and muscle aryl hydrocarbonreceptornucleartranslocatorlikeprotein 1）和miR-142-3p的表达来增强UVB诱导的DNA损伤修复，提出TKE 可作为治疗与UVB 诱导的损伤相关皮肤病的潜在候选者。Shah和He［17］研究紫外线诱发的DNA 修复的分子机制，提出可通过调节核苷酸切除修复过程来预防癌症发生和发展。Panich 等［18］进一步证明紫外线在诱导皮肤干细胞衰老过程中的损伤和氧化应激作用，并提出一种新的抑制皮肤细胞慢性光损伤发生的方法。

综上，本研究表明，重复UVA照射可直接作用于皮肤成纤维细胞DNA 碱基切除修复、DNA 错配修复及DNA 复制过程中关键酶的基因表达，从而影响皮肤成纤维细胞DNA 修复及DNA 复制过程，参与皮肤慢性光损伤的发生。该发现不仅进一步阐明了皮肤老化和光损伤的发生和修复机制，还可能为日后进一步研究皮肤光损伤及相关皮肤病的防治措施提供思路。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突