Periostin对骨质疏松大鼠牙槽骨缺损修复效果的影响

李豆豆 周维维 曹猛

骨髓间充质干细胞（BMMSCs）是骨组织工程中最常用的种子细胞［1］。骨质疏松状态时，BMMSCs的功能发生异常，由BMMSCs进行组织修复并不能达到良好的效果［2］。成骨特异性细胞因子2（periostin，POSTN），是相对分子质量为93 000的分泌型细胞外基质蛋白，主要在胶原丰富的结缔组织中表达，如骨（尤其是骨膜）、牙周韧带和心脏瓣膜［3］。POSTN受机械应力、PTH、生长因子等因素的影响参与调节骨内稳态［4］。目前治疗骨质疏松的唯一骨代谢药是小剂量、间歇性的给予PTH，而在所有受PTH调控的基因中，POSTN被证明是一种高反应基因［5-6］。POSTN在绝经后骨质疏松症的发病机理中扮演着重要的角色。

本实验通过模拟雌激素缺乏引起的骨质疏松状态，研究POSTN基因在去势大鼠BMMSCs中的表达和对其成骨分化能力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要材料、仪器

实验动物：4周龄雌性SD大鼠（第四军医大学动物实验中心提供）。

主要实验材料和仪器：α-MEM培养基（Hyclone，美国）；胎牛血清（杭州四季青公司）；胰蛋白酶、地塞米松、β-甘油磷酸钠、吲哚美辛、抗坏血酸、胰岛素、油红O、茜素红（Sigma-Aldrich，美国）；BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒、BCA（北京康为世纪）；RIPA裂解液（上海碧云天公司）；碱性磷酸酶试剂盒（南京建成公司）；RNAiso Plus、SYBR®Premix Ex TaqTMII（Takara，日本）；Micro-CT（Siemens Inveon，德国）；实时定量PCR仪（Prime Q，英国）；酶联免疫检测仪（BioTek Synergy HT，美国）；CO2孵箱、离心机（Thermo，美国）。

1.2 去势大鼠模型的构建

16只体重180～200 g、4周龄SD大鼠根据是否摘除卵巢分为去势组（OVX，n=8）和假手术组（SHAM，n=8），去势组结扎双侧输卵管并切除卵巢，假手术组仅切除卵巢周围等量脂肪组织。3个月后处死大鼠，无菌条件下剔除股骨周围软组织，并对股骨进行Micro-CT扫描和重建，随后比较2组指标，包括小梁厚度（Tb.Th），小梁数目（Tb.N），小梁间距（Th.Sp）和骨体积分数（BV/TV）。动物福利及所有手续均按照《实验室动物护理使用指南》（中国科技部，2006）执行，并经第四军医大学伦理委员会批准。

1.3 细胞分离与培养

无菌条件下取SD大鼠股骨及胫骨。充分暴露骨髓腔，用添加青、链霉素的α-MEM培养基冲出骨髓，反复轻轻吹打均匀，接种于25 cm2培养瓶中，置37℃、5%CO2和饱和湿度的培养箱中培养。48 h后半换液，以后每3天换液。当细胞融合至80% ～90%时，0.25%胰蛋白酶传代培养，细胞传至P3代使用。

1.4 Real-Time PCR

用RNAiso Plus提取细胞总RNA，以20μl体系将RNA反转录为cDNA。反应条件为：37℃15 min；85℃5 s；4℃。使用SYBR®Premix Ex TaqTMII进行Real-Time PCR实验。反应条件为：95℃30 s；95℃5 s、55℃30 s、72℃1 min共39个循环。引物具体见表1。结果以Ct值表示，以GAPDH为内参照，以2-ΔΔCt计算基因相对表达量。

1.5 病毒转染

携带POSTN的病毒（上海吉凯基因），病毒序列为 GV492（Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin）。细胞以5×104个/ml的密度接种在6孔板中，细胞贴壁后，用含有6μg/ml促细胞感染液（Polybreen）的2 ml新鲜培养液代替原培养基，并分别加入35μl携带有绿色荧光蛋白（eGFP）的免疫缺陷病毒AdPOSTN和AdE（空载体阴性对照）于培养基中［病毒体积=（MOI×细胞数目）/病毒滴度，预实验探索出当MOI=70%左右时可同时保证较高的感染效率和良好的细胞状态，本实验病毒滴度=1×108TU/ml］，转染12 h后更换为常规培养基。感染后72 h在荧光显微镜下观察转染的阳性率，Real-time PCR和Western Blotting检测POSTN的表达量。

表1 RT-PCR引物Tab 1 RT-PCR primers

1.6 细胞膜片的构建

细胞以3×105个/孔的浓度接种于6孔培养板，待细胞贴壁生长至密度达90% ～100%时，更换成膜诱导液（培养基添加100 mg/ml维生素C）。每3 d换液1次，7～10 d后可获得细胞膜片。

1.7 牙周缺损动物模型

24只4周龄SD大鼠按前述切除卵巢，术后3个月分为3组：对照组，OVX-BMMSCs组和POSTNOVX-BMMSCs组。无菌条件下，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定大鼠，提拉上下颌骨使尽量暴露其上颌牙列。用尖头手术刀切开上颌第一磨牙近中腭侧牙龈，轻轻翻开粘骨膜瓣，暴露第一磨牙近中根的牙槽骨骨面后，用直径为1.5 mm的牙科球状车针去除大鼠上颌第一磨牙近中根的近中牙槽骨，直至车针完全没入。柱状车针修整洞型使其达到手术标准统一为3 mm×2 mm×1.5 mm的箱装洞型，体积为9 mm3。OVX-BMMSCs组和POSTN-OVX-BMMSCs组在缺损处分别小心植入OVX-BMMSCs膜片和POSTN-OVXBMMSCs膜片，将粘骨膜瓣缝合。对照组不植入仅缝合。第3、6周进行Micro-CT扫描和重建分析。6周后麻药过量处死，分离上颌骨并用10% EDTA脱钙30 d左右，石蜡包埋，HE染色。

1.8 统计学分析

采用SPSS 17.0对进行统计分析，两独立样本比较用成组t检验，3组样本比较用one-way ANOVA，检验水准为α=0.05，P＜0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 成功构建去势大鼠模型

本实验摘除SD大鼠的双侧卵巢后3个月对大鼠股骨进行Micro-CT扫描和三维重建（图1）。与SHAM组相比，OVX组股骨的密度减少，可见断裂的骨小梁及骨髓空腔（图1）。OVX组Tb.Th、Tb.N和BV/TV等指标比SHAM组显著降低，而Th.Sp显著增加（图1），说明OVX组大鼠严重骨质疏松。

图1 骨质疏松大鼠模型的鉴定Fig 1 Identification of an ovariectomized（OVX）rat model

2.2 OVX-BMMSCs内POSTN表达水平降低

采用PCR检测POSTN的表达水平，发现OVXBMMSCs的POSTN的表达量比SHAM-BMMSCs明显降低（P＜0.05）（图2）。

2.3 上调POSTN的表达

转染72 h后用荧光显微镜观察eGFP的表达效率，AdPOSTN和AdE转染效率均在70% ～80%之间（图2）。PCR检测OVX-BMMSCs转染病毒后POSTN的mRNA表达水平，结果显示POSTN-OVX-BMMSCs内POSTN含量显著上调（P＜0.001）（图2）。

2.4 上调POSTN促进OVX-BMMSCs的骨向分化

成骨诱导培养SHAM-BMMSCs，OVX-BMMSCs和POSTN-OVX-BMMSCs 3组细胞，第3天和第7天检测相关成骨水平，显示OVX-BMMSCs与SHAM-BMMSCs相比，前者成骨正相关ALP、OCN和Runx2的mRNA表达水平明显降低，成骨负相关Sost表达水平升高。POSTN-OVX-BMMSCs和OVX-BMMSCs相比，前者的ALP、Runx2和OCN等mRNA表达水平整体呈升高趋势，Sost的表达水平降低（图3）。

图2 POSTN在3组细胞中的表达Fig 2 The expression level of POSTN in BMMSCs

图3 Periostin对BMMSCs成骨分化影响Fig 3 Influence of POSTN on osteogenic differentiation of BMMSCs

2.5 构建细胞膜片

在成膜诱导液中培养BMMSCs，7～10 d左右可见细胞成膜状（图4A）。HE染色可见细胞膜片的厚度，横断面可见由3～5层细胞构成（图4B）。

2.6 体内实验POSTN促进牙周缺损的修复

经过3周、6周，对大鼠上颌骨进行Micro-CT扫描，扫描重建后结果显示（图5）：在相同的时间点，POSTN-OVX-BMMSCs膜片组牙槽骨缺损处体积最小，愈合速度最快；OVX-BMMSCs膜片组次之。6周后对牙槽骨缺损处矢量状向切片并进行HE染色结果显示（图6），POSTN-OVX-BMMSCs膜片组新生牙槽骨面积最大，有明显的新生血管及大量的成熟成骨细胞，骨组织结构较完整，而空白组和OVX-BMMSCs膜片组中只有少量的成骨细胞和血管形成。以上均提示POSTN-OVX-BMMSCs膜片组修复牙槽骨缺损的能力明显强于OVX-BMMSCs细胞膜片和对照组。

图4 细胞膜片的构建Fig 4 Construction of cell sheets

图5 骨缺损区进行Micro-CT扫描Fig 5 Micro-CT scanning of the defect area

3 讨 论

骨质疏松的患者常常遭受骨折和骨折后难以愈合的困扰，极大降低了生活质量［7］。骨髓间充质干细胞较容易分离，有多向分化潜力，并保留“归巢”特点，使得它们在骨组织修复以及治疗相关疾病中成为第一选择。然而，雌激素缺乏的骨质疏松大鼠的BMMSCs骨向分化能力降低、成骨水平下降，由自体BMMSCs移植进行骨再生的修复效果并不理想，而恢复受损的BMMSCs的正常功能可能是治疗的关键［8］。

图6 骨缺损区进行HE染色Fig 6 HE staining of the defect area

POSTN是一种分泌型的细胞外基质蛋白，最初是从小鼠成骨细胞系MC3T3-E1 cDNA文库中克隆出的一种具有调节成骨细胞分化和粘附功能的分子［9］。POSTN属于成束蛋白-I家族，此家族的蛋白与成骨关系密切，POSTN在调节全身骨代谢中发挥了关键性作用［10-11］。运动能改善骨质疏松，而运动产生复杂的机械效应，如重复压缩或剪切力等，大大增加了POSTN的表达，同时POSTN通过semaphorin-3A抑制破骨细胞分化［12］。骨折后POSTN的表达水平再一次升高，说明POSTN在骨代谢中有重要作用［13］。这些研究提示POSTN在骨发育和重塑过程中具有重要作用。

本实验通过摘除双侧卵巢成功构建了骨质疏松大鼠模型，并分离培养了OVX-BMMSCs和SHAMBMMSCs。通过PCR检测骨质疏松大鼠中POSTN的表达水平，发现OVX-BMMSCs的POSTN的表达量比SHAM-BMMSCs明显降低。OVX-BMMSCs的骨向分化能力存在明显缺陷，这与以前的许多研究都是一致的［14］。通过逆转录病毒成功上调POSTN的表达后，PCR结果显示POSTN-OVX-BMMSCs的成骨水平高于OVX-BMMSCs，这阐明上调POSTN可以恢复OVXBMMSCs的成骨能力。反过来，这也证实了POSTN可能是监测骨代谢活动的指标之一［15］。

POSTN与牙周关系密切，缺失小鼠牙齿发育异常，并在牙周炎以及牙周术后表达增加［16］。在本实验应用细胞膜片技术，在骨缺损区分别植入OVXBMMSCs和POSTN-OVX-BMMSCs膜片。发现，在骨缺损区POSTN-OVX-BMMSCs膜片更能促进新生骨和血管的再生，促进骨的修复愈合，这与POSTN在组织创伤和伤口修复的组织中高表达有关［17］。

4 结 论

POSTN可改善和促进去势大鼠BMMSCs的成骨能力，可能有利于绝经后骨质疏松大鼠骨的再生。