实验性牙移动及其引起的咬合改变对牙周神经末梢分布及相关蛋白表达的影响

张羽博翰 杨鸿旭 王美青 鹿蕾

牙周神经末梢可感受牙齿承受的咬合力和正畸矫治力［1］。正畸牙移动可造成牙周膜的形态变化［2］，致牙周神经末梢出现超微结构变化［3］。咬合改变也可影响牙周神经末梢的形态［4-6］。蛋白基因产物9.5（protein gene product 9.5，PGP 9.5）可用以标记牙周神经末梢［7］。牙周膜内的终末雪旺细胞对牙周神经末梢有重要的支持、营养和功能辅助作用［8-9］。

本实验旨在研究实验性牙移动及其引起的咬合改变可否影响牙周神经末梢标记物PGP 9.5、终末雪旺细胞标记物S-100和神经营养素-3（neurotrophin-3，NT-3）的表达。

1 材料与方法

1.1 实验动物和牙齿移动及咬合改变模型

48只雌性SD大鼠（8周龄，体重200～220 g），购买自第四军医大学实验动物中心。随机分为实验组和对照组（各24只）。

实验组大鼠，1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）全麻，用一段正畸橡皮圈（3 M Unitek，3/16#）进行分牙操作，即将橡皮圈塞入左上第二磨牙和第三磨牙之间，以及右下第二磨牙和第三磨牙之间。确保皮筋不高出平面。皮筋自身的弹力及遇唾液后的膨胀力，推左上和右下第三磨牙的牙冠向远中移动，使第二磨牙和第三磨牙的牙冠之间逐渐形成宽约0.8 mm的间隙，并改变了上下第三磨牙之间的咬合关系。空白对照组大鼠不做分牙处理（图1）。

图1 实验性牙移动大鼠分牙模式图Fig 1 The conceptual diagram of the experimental tooth-moving procedure

1.2 取材及切片制作

分牙后第1、3、7、14、21、24 d后（每个时间点n=4），戊巴比妥钠腹腔注射全麻（0.1 g/ml），4%多聚甲醛固定液400 ml灌流内固定。取出双侧上下颌牙槽骨，置于4%多聚甲醛液中进行后固定24 h。

甲酸-甲酸钠脱钙液（4 mol/L甲酸和0.5 mol/L甲酸钠）脱钙2周。饱和碳酸锂溶液中中和6～8 h。梯度乙醇序列脱水，浸蜡包埋，使牙齿长轴垂直于切面。石蜡切片机切片（厚度5μm）。

1.3 免疫荧光染色

常规脱蜡至水。复合消化液37℃孵育10 min，抗原修复液孵育30 min。正常山羊血清37℃下孵育30 min以封闭内源性结合位点。抗体孵育如下：①一抗：PGP 9.5一抗（1∶50，ab8189，Abcam，美国）进行单标或S-100（1∶100，ab14849，Abcam）与NT-3（1∶100，ab16640，Abcam）抗体混合液进行双标，4℃孵育过夜，次日室温复温30 min；②二抗：FITC标记山羊抗小鼠二抗（1∶100，A0568，Beyotime，上海碧云天公司）进行单标或FITC标记山羊抗小鼠二抗和Cy3标记山羊抗兔二抗（1∶100，A0516，Beyotime）的混合液进行双标，37℃温箱孵育30 min。

1.4 封片，观察

甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察（Olympus公司，FV1000，日本），观察部位：移动牙（左侧上颌第三磨牙）和移动牙的对颌牙（右侧上颌第三磨牙）远中根的根中下1/3（图2），因为正常情况下此处为牙周神经末梢密度最大区域［1］。

图2 观察区域垂直向所在水平，即第三磨牙远中根根中下1/3Fig 2 The observation area in the vertical direction，located at the apical and median third of the distal root of the third molar

1.5 统计学方法

应用SPSS 12.0统计软件，单因素方差分析分别比较各时间点对照组和移动牙组，或对照组和移动牙的对颌牙组以下参数：①牙周神经末梢PGP 9.5阳性面积百分比；②终末雪旺细胞标记物S-100阳性面积百分比；③神经营养因子NT-3相对光密度。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 牙周膜内神经末梢标记物PGP 9.5免疫荧光染色结果

2.1.1 空白对照组 远中根的PGP 9.5阳性信号主要分布在牙周膜腔的牙槽骨侧，中间带和牙齿侧则很少（图3）。

2.1.2 实验组 在移动牙及移动牙的对颌牙，远中根的PGP 9.5阳性信号分布较对照组更接近于牙齿侧，PGP 9.5阳性面积百分比较对照组出现一过性减少，移动牙PGP 9.5阳性面积百分比最低值出现在牙移动后第3天，移动牙的对颌牙最低值出现在第14天，2组均于第24天恢复至基线水平（图3）。

2.2 终末雪旺细胞标记物S-100和神经营养因子NT-3免疫荧光染色结果

在移动牙及移动牙的对颌牙，远中根的终末雪旺细胞标记物S-100阳性面积百分比和神经营养因子NT-3相对光密度较对照组一过性地增多，移动牙的峰值出现在牙齿移动后第3天，移动牙的对颌牙峰值出现在牙齿移动第14天，2组均于第24天恢复至基线水平。免疫荧光双标结果显示NT-3与S-100的表达存在广泛双标，即存在广泛共表达（图4）。

图3 牙周组织内PGP 9.5免疫荧光染色及统计结果 （×200）Fig 3 The immunofluorescent observation and quantitative analysis of PGP 9.5 immunoreactivity in the periodontal tissue（×200）

3 讨 论

本研究发现，实验性牙移动及其引起的咬合变化可引起移动牙及其对颌牙牙周神经末梢标记物PGP 9.5、终末雪旺细胞标记物S-100及神经营养因子NT-3在牙周膜内的表达及分布出现一过性的改变，与移动牙相比，移动牙的对颌牙的变化出现较晚，恢复更快。

咬合改变常可造成牙周神经末梢形态改变。后牙失咬合可引起牙周神经末梢显微分布出现向牙周膜中间带和牙齿侧伸展的趋势［4］。切牙失咬合可使切牙舌侧牙周神经末梢在显微结构上出现分枝减少等异常［10］。这些改变被认为是由于牙周膜缺乏生理性力刺激而造成的萎缩征象。在前牙反［5］和咬合升高［6］的动物模型中，牙周神经末梢的超微结构也会出现伸出长的突起等变化。正畸牙移动也会影响牙周膜的形态并使其表达多种生物因子，如MMP-13、MMP-9和IL-8等［11-13］，这些因子可能是本实验中移动牙牙周神经末梢标记物PGP 9.5表达变化的原因。牙周神经末梢的显微形态及分布是其功能基础，因此本实验观察到的牙周神经末梢标记物PGP 9.5的一过性变化可能是临床上移动牙齿感觉异常的原因。

牙周终末雪旺细胞对牙周膜内的神经末梢起着重要的支持、营养和功能辅助作用。终末雪旺细胞将牙周神经末梢包裹，并向周围牙周纤维伸出舌状突起，辅助牙周神经末梢的力信号传导［8-9］。在神经受损后再生的过程中，终末雪旺细胞可改变其形态和分布，在神经再生的过程中起重要的引导和营养作用［14-15］。激活状态的雪旺细胞可增加其神经营养子的表达［16-17］。在本实验中，移动牙的牙周终末雪旺细胞标记物S-100的表达出现一过性增多，且其增多与PGP 9.5表达的降低同时发生。NT-3是外周感觉神经的重要神经营养因子。NT-3可参与皮肤力感受器的发育和功能发挥［18-19］。另外，NT-3还是雪旺细胞的自分泌因子，可支持成熟雪旺细胞的存活，从而促进神经再生［20-21］。本实验牙周膜内NT-3的表达和S-100同时升高，且S-100与NT-3存在广泛共表达。说明牙周膜内增多的NT-3主要由牙周雪旺细胞分泌，可能发挥了支持雪旺细胞存活的作用，从而在牙周神经末梢的改建和再生中发挥重要作用。除雪旺细胞外，神经元、角质细胞等也可表达NT-3［22-23］。在NT-3的峰值期（即移动牙的第3天和移动牙对颌牙的第14天），大多数NT-3均与S-100有共表达，但有少量NT-3并未与S-100双标（图4），说明有一部分NT-3并不来自于雪旺细胞，其来源有待进一步实验阐明。

本实验还发现，除了移动牙，移动牙的对颌牙牙周膜中PGP9.5、S-100和NT-3也出现一过性的变化。说明因正畸皮圈的弹力移动了受力牙，使其与移动牙的对颌牙出现尖窝关系的改变，从而使移动牙的对颌牙的牙周膜也承受了异常的咬合力。然而这些变化较移动牙出现晚且恢复快，说明这种咬合改变引起的牙周组织改建发生较缓和。

图4 牙周组织内S-100和NT-3免疫荧光双标染色及统计结果 （×200）Fig 4 The immunofluorescent observation and quantitative analysis of S-100 and NT-3 immunoreactivity in the periodontal ligament（×200）

4 结 论

实验性牙移动及其引起的异常咬合力可引起牙周神经末梢标记物的一过性改变，终末雪旺细胞及其表达的NT-3可能在其中起着积极作用。