基于响应面分析法优化北虫草菌糠中多糖提取条件的研究

余 蕾，阎光宇，李凤林

北虫草又称蛹虫草，为北冬虫夏草的简称，真菌门虫草属。北虫草主要生长于辽宁、吉林、云南等地，北虫草与冬虫夏草为同属异种真菌，两者有着相似的化学成分、营养成分以及药用功效[1]，北虫草在全国各地得以广泛栽培，目前全国70%左右的北虫草产于辽宁。市场上的北虫草大部分都是人工培育的，是用大米或小麦等谷物作为固体培养基培育而成的北虫草子实体。北虫草中含有蛋白质、氨基酸、虫草多糖、虫草素、虫草酸、腺苷等多种生物活性物质，是营养价值很高的食药用虫、菌结合的真菌。虫草多糖作为北虫草最重要的有效成分之一，可提高人体免疫功能，此外还具有抗氧化、抗炎、降血脂等功效[2-3]。

食用菌的菌丝残体以及培养料残渣被称为食用菌菌糠，其含有丰富的多糖、氨基酸、微量元素及一些食用菌生长代谢产物[4]，北虫草子实体采收后会产生大量的菌糠。据前续研究资料报道[4-6]，北虫草菌糠中虫草多糖的含量高达10%以上，从废弃菌糠中提取多糖已成为食用菌菌糠的再次开发与利用的研究热点之一[7]。本研究采用复合酶酶解法，对以小麦为固体培养基栽培北虫草后得到的菌糠中的虫草多糖的提取进行研究，对这些长满菌丝体的固体培养残基中的虫草多糖进行提取并利用，可以减少菌糠废弃对环境造成的污染，并提高北虫草栽培和生产的附加值，具有非常广泛的应用开发前景。

1 材料与方法

1.1 主要材料与设备

北虫草菌糠，沈阳恒生生物科技发展有限公司提供；复合酶(果胶酶∶纤维素酶∶菠萝蛋白酶=1∶1∶1)，均为食品级；无水葡萄糖，苯酚、浓硫酸，乙醇、丙酮、乙醚，均为分析纯。

JA403电子分析天平，HC-SSD高速粉碎机，DHG-9146A干燥箱， T6紫外可见分光光度计，HH.S11-6恒温水浴锅，JJDI-18D台式离心机，80目标准筛。

1.2 试验内容与方法

1.2.1 北虫草菌糠多糖提取工艺流程 北虫草菌糠预处理→复合酶(果胶酶∶纤维素酶∶菠萝蛋白酶=1∶1∶1)酶解→灭酶、冷却→离心过滤→纯化→干燥→称重→密封→保藏。

1.2.2 北虫草菌糠预处理 将晾晒干的北虫草菌糠用粉碎机粉碎后在50 ℃干燥箱中干燥至恒重，再进一步加以粉碎以过80目筛，密封保存于阴凉干燥处。

1.2.3 北虫草菌糠多糖酶解提取条件试验设计 (1)北虫草菌糠多糖酶解提取条件单因素试验研究。在其余工艺条件及参数不变的条件下，通过单因素试验分别研究复合酶(果胶酶∶纤维素酶∶菠萝蛋白酶=1∶1∶1)添加量、酶解温度、酶解时间、酶解pH等因素对北虫草菌糠多糖提取率的影响，为北虫草菌糠多糖酶解提取条件的优化提供依据。(2)北虫草菌糠多糖酶解提取条件的优化试验设计。利用Box-Behnken中心组合试验设计法，在单因素试验的基础上，对复合酶(果胶酶∶纤维素酶∶菠萝蛋白酶=1∶1∶1)添加量、酶解温度、酶解时间、酶解pH等试验因素进行四因素三水平响应面分析方法试验，以多糖提取率为指标，确定北虫草菌糠多糖酶解提取的最优条件。

1.2.4 北虫草菌糠中虫草多糖的纯化 在北虫草菌糠酶解后经灭酶冷却、离心过滤所得的多糖清液中加入4倍体积的95%乙醇，放4 ℃冰箱中静置过夜，于次日将醇析液经离心过滤后取其沉淀。沉淀再用无水乙醇、丙酮、乙醚依次分别洗涤2次后于50 ℃干燥箱中干燥至恒重，得虫草多糖。

1.2.5 北虫草菌糠中多糖提取率的计算 (1)葡萄糖标准曲线。配制0.1 mg/mL质量浓度的葡萄糖溶液，准确量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于试管中，用蒸馏水定容至1.0 mL。采用苯酚-硫酸法绘制葡萄糖标准曲线，得回归方程。(2)北虫草菌糠中多糖的测定。

准确称取样品50 mg加蒸馏水溶解至100 mL并摇匀，从中准确吸取10 mL再次用蒸馏水定容至100 mL，在490 nm波长处测定吸光度。根据1.2.5(1)中所得回归方程计算虫草多糖的质量浓度，进而求出北虫草菌糠中多糖的提取率。多糖提取率的计算公式如下：

式中：C——虫草多糖的质量浓度(mg/mL)；

V——虫草多糖的样品液体积(mL)；

m1——虫草多糖质量(g)；

m2——虫草多糖取样量(mg)；

M——北虫草菌糠粉末取样量(g)。

2 结果与分析

2.1 北虫草菌糠多糖酶解提取条件的确定

2.1.1 复合酶添加量对北虫草菌糠中多糖提取率的影响 称取一定量的北虫草菌糠粉末，加入适量蒸馏水摇匀，加入北虫草菌糠干重的0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的复合酶(果胶酶∶纤维素酶∶菠萝蛋白酶=1∶1∶1)，搅拌溶解后使用HAc-NaAc缓冲溶液调节pH至5，于45 ℃恒温水浴锅中酶解120 min。再在沸水锅中灭酶15 min使复合酶失去活性，冷却至室温，过滤、纯化、干燥，测定多糖提取率。

图1 复合酶添加量对北虫草菌糠中多糖提取率的影响

图2 酶解温度对北虫草菌糠中多糖提取率的影响

复合酶添加量与北虫草菌糠中多糖提取率的关系如图1所示。随着复合酶(果胶酶∶纤维素酶∶菠萝蛋白酶=1∶1∶1)添加量的增加，北虫草菌糠的多糖提取率逐渐提高，可能是因为北虫草菌糠多糖较多地被果胶、纤维素和蛋白质包藏，通过酶解作用将其释放了出来。但当复合酶添加量达到1.0%以后，其多糖提取率趋于平缓，增加程度不明显。因此，确定复合酶(果胶酶∶纤维素酶∶菠萝蛋白酶=1∶1∶1)添加量的适宜范围为0.5%～1.5%。

2.1.2 酶解温度对北虫草菌糠中多糖提取率的影响 称取一定量的北虫草菌糠粉末，加入适量蒸馏水摇匀，加入北虫草菌糠干重的1.0%的复合酶(果胶酶∶纤维素酶∶菠萝蛋白酶=1∶1∶1)，搅拌溶解后使用HAc-NaAc缓冲溶液调节pH至5，于35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃恒温水浴锅中酶解120 min。再在沸水锅中灭酶15 min使复合酶失去活性，冷却至室温，过滤、纯化、干燥，测定多糖提取率。

酶解温度与北虫草菌糠中多糖提取率的关系如图2所示。北虫草菌糠的多糖提取率随着酶解温度的升高而逐渐提高，当温度升高至50 ℃时达到最高，其后多糖提取率却渐渐降低，这主要是因为较高的温度反过来对酶的活性产生了抑制作用，甚至是钝化。因此，确定酶解温度的适宜范围为45 ℃～55 ℃。

图3 酶解时间对对北虫草菌糠中多糖提取率的影响

图4 酶解pH对对北虫草菌糠中多糖提取率的影响

2.1.3 酶解时间对北虫草菌糠中多糖提取率的影响 称取一定量的北虫草菌糠粉末，加入适量蒸馏水摇匀，加入北虫草菌糠干重的1.0%的复合酶(果胶酶∶纤维素酶∶菠萝蛋白酶=1∶1∶1)，搅拌溶解后使用HAc-NaAc缓冲溶液调节pH至5，于45 ℃恒温水浴锅中酶解30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min。再在沸水锅中灭酶15 min使复合酶失去活性，冷却至室温，过滤、纯化、干燥，测定多糖提取率。

酶解时间与北虫草菌糠中多糖提取率的关系如图3所示。随着酶解时间的增加，北虫草菌糠的多糖提取率逐渐提高，但120 min以后，其多糖提取率却有所降低，可能是因为长时间的酶解使大分子多糖中的糖苷键发生了断裂而对多糖的提取率产生了影响。因此，确定酶解时间的适宜范围为9 0min～150 min。

2.1.4 酶解pH对北虫草菌糠中多糖提取率的影响 称取一定量的北虫草菌糠粉末，加入适量蒸馏水摇匀，加入北虫草菌糠干重的1.0%的复合酶(果胶酶∶纤维素酶∶菠萝蛋白酶=1∶1∶1)，搅拌溶解后使用HAc-NaAc缓冲溶液调节pH至4.5、5、5.5、6、6.5、7，于45 ℃恒温水浴锅中酶解120 min。再在沸水锅中灭酶15 min使复合酶失去活性，冷却至室温，过滤、纯化、干燥，测定多糖提取率。

酶解pH与北虫草菌糠中多糖提取率的关系如图4所示。北虫草菌糠的多糖提取率随着酶解pH的升高先提高后降低，这是因为pH过高对酶的活性产生了抑制作用，从而影响了多糖的提取率。因此，确定酶解pH的适宜范围为5～6。

表1 响应面分析试验因素与水平表

表2 响应面分析北虫草菌糠多糖提取条件方案及结果

2.2 北虫草菌糠多糖酶解提取条件的优化试验设计

2.2.1 响应面分析北虫草菌糠多糖提取方案与结果 利用Box-Behnken(BBD)中心组合试验设计法，以北虫草菌糠中多糖提取率为参考指标，根据单因素试验结果，选择复合酶添加量、酶解温度、酶解时间、酶解pH四因素三水平进行响应面分析试验，来确定复合酶酶解提取北虫草菌糠中多糖的最优条件。表1为试验因素与水平的设计，结果见表2。

2.2.2 北虫草菌糠多糖提取回归方程的建立及试验分析 利用Design expert 8.0 统计软件建立数学模型，获得北虫草菌糠多糖提取的四因素与相应值间关系的多元回归方程：Y=7.83+2.26A-0.73B+0.11C-0.54D-0.93AB+0.23AC-0.62AD+0.053BC+0.40BD-0.14CD-1.86A2-0.14B2-0.35C2-0.94D2。

续表2 响应面分析北虫草菌糠多糖提取条件方案及结果

从表3方差分析中可看出该回归模型极其显著(P<0.000 1)，说明模型的建立是具有意义的。对表3中回归系数的显著性检测结果分析可知，该模型一次项中的A、B、D和二次模型中的AB、A2、D2极其显著(P<0.01)，二次模型中AD为显著水平(P<0.05)；其他各项则不显著(P>0.05)。该模型的决定系数R2=102.851/106.6121=0.964 7。由此可以看出，各影响因素对北虫草菌糠中多糖提取率的影响并不是简单的线性关系。各因素在所选的水平范围内，按其对结果影响的大小依次排列为：A(复合酶添加量)> B(酶解温度)> D(酶解pH)> C(酶解时间)。模型在去除不显著项后，Y=7.83+2.26A-0.73B-0.54D-0.93AB+0.23AC1.86A2-0.94D2。通过方差分析对回归方程进行检验得出结论，该模型具有较好的拟合度，利用该模型可以对北虫草菌糠中多糖的复合酶酶解提取条件进行分析及预测。

2.2.3 响应面及其等高线分析 根据北虫草菌糠中多糖提取模型的响应面及其等高线图，对影响多糖提取率的主要因素及其相互作用进行探讨。仔细对拟合响应面的形状及特点进行观察，从中分析A(复合酶添加量)、B(酶解温度)、C(酶解时间)、D(酶解pH)等试验因素对北虫草菌糠中多糖提取率的影响。具体见图5-10。

表3 北虫草菌糠多糖提取二次模型及其回归系数的方差分析

注：**差异极显著(P<0.01)，*差异显著(0.05

图5酶解时间和复合酶添加量交互作用的响应面和等高线图6酶解pH和酶解时间交互作用的响应面和等高线图7酶解时间和酶解温度交互作用的响应面和等高线图8酶解温度和复合酶添加量交互作用的响应面和等高线

从图5、图6和图7中可以看出，A、B以及D与C的相互作用都不明显，等高线沿着A、B、D方向变化较快，而沿着C方向变化不明显。在试验水平下，A、B以及D相较于C对响应值(多糖提取率)的影响要显著。在A、B、D三者的相互交互作用中，表现为随着A、B、D的变化，交互作用显著增加，且对响应值(多糖提取率)的影响也十分显著(图8、图9、图10)。

图9酶解pH和复合酶添加量交互作用的响应面和等高线图10 酶解pH和酶解温度交互作用的响应面和等高线

2.2.4 北虫草菌糠中多糖提取条件的确定 通过软件Design-Expert 8.0 求解方程，并对所得方程进行最优化处理，得到复合酶酶解提取北虫草菌糠中多糖的优化条件为：复合酶(果胶酶∶纤维素酶∶菠萝蛋白酶=1∶1∶1)添加量1.5%、酶解温度45 ℃、酶解时间135 min 、酶解pH5，此时北虫草菌糠中多糖的提取率可达10.51%。

在实际应用中考虑到操作的实际可行性，以及缩短时间周期、减少能耗及节省成本等目的，修正复合酶酶解提取北虫草菌糠中多糖的最优条件为：复合酶添加量1.0%、酶解温度45 ℃、酶解时间120 min 、酶解pH5。在该修正条件下进行验证试验以检验结果的可靠性，得出北虫草菌糠中多糖的实际提取率为10.01%，与理论预测值基本吻合，比单因素试验中的最高提取率要高出1.0%。由此，利用响应面分析法得到的北虫草菌糠中多糖提取的优化工艺参数真实可靠，具有实际应用价值。

3 结 论

本试验采用复合酶(果胶酶∶纤维素酶∶菠萝蛋白酶=1∶1∶1)酶解工艺应用于北虫草菌糠中虫草多糖的提取。通过对北虫草菌糠多糖酶解的复合酶添加量、酶解温度、酶解时间、酶解pH单因素试验的基础上，针对这些因素进行四因素三水平响应面分析试验，确定北虫草菌糠中多糖复合酶酶解提取的最优条件为：复合酶(果胶酶∶纤维素酶∶菠萝蛋白酶=1∶1∶1)添加量1.0%、酶解温度45 ℃、酶解时间120 min 、酶解pH5。在此条件下北虫草菌糠中虫草多糖的提取率为10.01%，为北虫草菌糠的综合开发利用提供了实际参考依据。