黄芪多糖预处理对肾缺血再灌注损伤大鼠细胞凋亡的影响

南阳市第二人民医院肾病风湿科，河南 南阳 473000

肾缺血再灌注损伤(Renal Ischemical Reperfusion Injury，RIRI)是指在肾缺血的基础上，当恢复血流灌注后，损伤不仅没有改善，反而加重的现象[1]。RIRI发病机制复杂，其中继发性的细胞凋亡可能起到重要作用[2]，通过抑制细胞凋亡来作为治疗的靶点，为研究开发新型药物开辟了新的途径。从中医学的角度来看，细胞凋亡与中医正气学说有密切联系[3]。RIRI根据其临床表现可将其归于“关格”“虚劳”“溺毒”“癃闭”等范畴，其病因病机皆与脾肾有关，脾肾两虚易致浊毒内蕴、邪气增多[4]。《素问·通评虚实论》曰：“邪气盛则实，精气夺则虚”。

黄芪为豆科类植物膜荚黄芪或者蒙古黄芪干燥后的根，其味甘、性微温，归脾肺经。《本草汇言》赞其为“补肺健脾，实卫敛汗，驱风运毒之药也”。国内外研究表明其具有保护肾脏，对肾脏疾病具有治疗作用[5]。黄芪多糖(Astragalus Polysac charides，APS)为黄芪的有效成分之一，在心肌[6]、脑[7]的缺血再灌注损伤中具有抗细胞凋亡的作用。肾脏作为缺血再灌注损伤的常见器官之一，APS是否通过抗细胞凋亡，发挥对RIRI的保护作用，还未见相关报道。实验拟通过在大鼠体内复制RIRI模型，从抗细胞凋亡角度分析APS对RIRI作用的机制，以期为临床APS的运用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性成年S-D大鼠30只，体重200～300 g左右，购于山西医科大学实验动物中心，编号：SXYK180605120。分组饲养，室温控制在20～25 ℃，空气湿度控制在50%～55%，饮食与饮水均标准化供给。

1.1.2 实验药品和试剂 APS(批号：1803152230，上海康舟真菌多糖公司)；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(批号：18I03AJ，武汉博士德生物工程有限公司)；肌酐(Cr)试剂盒、尿素氮(BUN)试剂盒均购自于南京建成生物工程研究所，批号皆为201809036；Bax(Bcl-2 associated X蛋白质，批号：2343179)、Bcl-2(B淋巴细胞瘤-2基因，批号：185641)免疫组化试剂盒购自于武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.3 仪器 7020型全自动生化分析仪(日本HITAHI公司)；TS-12U型生物组织自动脱水机(孝感市宏业医用仪器有限公司)；TDK-BMB型石蜡冰冻切片机(浙江金华市益迪医疗设备厂)；显微镜(日本尼康公司)；DMR+Q550型病理图像分析仪(德国Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模和分组 30只大鼠随机分为3组：模型组、假手术组和APS干预组，每组10只。手术前12 h禁食不禁水，各组动物以45 mL/kg剂量戊巴比妥钠腹腔注射进行全身麻醉。仰卧位固定，沿腹正中切开腹部，模型组大鼠游离双侧肾脏并分离肾动脉，用无创动脉夹夹闭双侧肾动脉60 min，然后松开动脉夹，肾脏由紫黑色变为鲜红，表明模型制备成功，如果松开动脉夹5 min后，肾脏颜色没有变为鲜红色，说明模型制作失败，这种大鼠被剔除。假手术组只沿腹正中切开腹部，并分离左右肾脏，不夹闭肾动脉。APS干预组在模型制作前给予450 mg/kg APS灌胃，连续用药10 d，1次/d，假手术组与模型组给予等量的生理盐水灌胃。各组大鼠手术后单笼常规饲养，48 h后肾动脉采血，然后处死大鼠并摘取肾脏组织。

1.2.2 血清BUN、Cr含量测定 将采集的血液，以3 000 r/min离心15 min后提取血清。参照说明书通过全自动生化分析仪测定血清中的BUN、Cr含量。

1.2.3 TUNEL法检测肾脏细胞凋亡 取肾组织固定，常规石蜡包埋、切片，严格参照细胞凋亡检测试剂盒说明书对肾脏凋亡细胞进行检测。光镜下凋亡细胞核染色为棕黄色。在显微镜(×400)下，每张切片随机选择5个非重叠视野进行观察，计数凋亡细胞数目，取平均值，计算细胞凋亡指数，具体公式为：细胞凋亡指数=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%

1.2.4 免疫组化检测肾组织Bax和Bcl-2蛋白表达 制备肾组织切片，用SABC免疫组化染色法检测Bax、Bcl-2的表达，操作步骤严格参照试剂盒说明书。Bax和Bcl-2表达阳性结果为胞浆染色呈棕色，不着色者为阴性。在显微镜(×400)下，每张切片随机选择5个非重叠视野进行观察，计算阳性反应区域面积的平均光密度值(OD)。

2 结果

2.1 各组大鼠血清BUN、Cr水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠血清BUN和Cr含量明显升高(P<0.01)；与模型组比较，APS干预组大鼠血清BUN和Cr含量明显下降(P<0.01)。具体结果见表1。

表1 各组大鼠血清BUN和Cr水平比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.2 各组大鼠细胞凋亡指数比较 与假手术组比较，模型组肾脏细胞凋亡指数明显升高(P<0.01)；与模型组比较，APS干预组大鼠肾脏细胞凋亡指数明显降低(P<0.01)。具体结果见表2、图1。

表2 各组大鼠肾组织细胞凋亡指数比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.3 各组大鼠肾组织Bax和Bcl-2蛋白表达 与假手术组比较，模型组肾脏Bax表达明显升高，Bcl-2表达明显下降(P<0.01)；与模型组比较，APS干预组大鼠肾脏Bax表达明显降低，Bcl-2表达明显升高(P<0.01)。具体结果见表3、图2。

组别BaxBcl-2假手术组0.38±0.060.95±0.15模型组0.85±0.13∗0.46±0.06∗APS干预组0.56±0.85#0.76±0.11#

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

RIRI是因肾供血障碍后血流再灌注而导致的常见的应激性疾病，临床最常见于肾移植术后[8]。RIRI导致肾脏血管损伤，引发肾小管代谢紊乱甚至坏死，进而影响肾血流，最终导致肾细胞凋亡、坏死，直至肾功能衰竭。通过本实验研究发现与假手术组比较，模型组大鼠血清BUN和Cr含量明显升高(P<0.01)；与模型组比较，APS干预组大鼠血清BUN和Cr含量明显下降(P<0.01)。提示RIRI大鼠肾功能下降，通过APS干预作用后肾功能得到改善，说明APS对RIRI大鼠肾脏具有保护作用。

细胞凋亡是指细胞在一定生理或病理条件下，通过启动内部自身机制，激活内源性核酸内切酶而引起自身细胞死亡的现象[9]，其在RIRI病理生理中发挥重要作用[10]。细胞凋亡与多种基因表达有关，其中Bcl-2家族为现在研究较为深入的调控基因之一。迄今已发现Bcl-2家族包括20多种成员，按其功能可分为抑制凋亡的亚家族(包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、mcl-1、A1/Bfl-1等)和促进凋亡的Bax亚家族(包括Bax、Bcl-XS、Bad、Bik、Bak、Bid、Hrk等)，其中Bcl-2和Bax是最主要的成员。Bcl-2具有抗细胞凋亡作用，而Bax具有促进细胞凋亡的作用，在正常情况下Bcl-2与Bax调控作用保持动态平衡，当Bcl-2表达程度升高或者Bax的表达程度受到抑制时，就会抑制细胞凋亡[11]，这种抑制的机理包括以下几种可能：①对促细胞凋亡基因信号传达产生阻隔作用，或使得相关基因失效[12]；②Ca2+内流在细胞中发生变化，使凋亡受到抑制；③抑制氧自由基的产生，减少氧化应激等。而Bax表达的增强，使线粒体通透性增大，进而使细胞内引入大量的细胞色素C，促进细胞凋亡[12]。通过本研究显示，与假手术组比较，模型组大鼠肾脏细胞凋亡指数明显升高，且Bax表达明显升高、Bcl-2表达明显下降(P<0.01)；与模型组比较，APS干预组大鼠肾脏细胞凋亡指数明显降低，且Bax表达明显降低、Bcl-2表达明显升高(P<0.01)。说明APS通过对凋亡基因进行调节的作用，抑制细胞凋亡，保护肾脏，避免产生肾损伤。

黄芪作为传统名贵中药，有补气升阳、固表止汗、行水消肿和托毒生肌的功效，有“补气诸药之最”之称。APS作为黄芪中最重要的一种药用物质，大量实验证明其具有抗细胞凋亡的作用。综上所述，APS预处理具有减轻肾脏细胞凋亡，改善RIRI肾功能的作用，其机制可能与Bax蛋白表达下调，以及Bcl-2蛋白表达上调有关。