Tc17细胞对乙肝相关慢加急性肝衰竭病情进展及乙肝病毒清除的影响

张耿林，徐士丞，张 婷，林潮双，彭 亮，高志良

（中山大学附属第三医院1.感染科，2.超声科，广东广州 510630）

慢加急性肝衰竭是肝病领域常见的急危重症，是在慢性肝病基础上出现的急性肝功能失代偿。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是我国慢加急性肝衰竭的主要原因。目前我国有慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者约2 000万，每年约有60万CHB患者进展为乙肝相关慢加急性肝衰竭（HBV related acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF）。HBV-ACLF发病迅猛，治疗难度极大，病死率高达60%～80%［1-2］。HBV-ACLF 的发病机制极其复杂，目前认为是环境、HBV病毒及宿主等多因素相互作用的结果，但确切的机制尚未阐明。国内外学者普遍认为免疫细胞介导的炎症反应是HBV-ACLF发病机制的核心环节［3-4］。Tc17细胞（IL-17-producing CD8+T cells）是新近发现的CD8+T细胞亚群，以分泌白介素-17（interleukin-17，IL-17）为主要特点［5］，其在HBV-ACLF中对病情进展及清除乙肝病毒的作用，目前尚不清楚。本研究通过检测HBV-ACLF外周血Tc17细胞表达，并分析其与病情进展及乙肝病毒清除的关系，发现Tc17细胞介导的炎症反应有助于清除HBVDNA，但过激的炎症反应将导致患者病情进展。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究已得到中山大学附属第三医院伦理委员会的批准，所有患者均签署知情同意书。收集于2009年4月至2014年8月在我院感染科住院的43例HBV-ACLF患者，其中男性41例，女性2例，平均年龄43岁。同时收集20例CHB患者及12名健康体检者（normal control，NC）为对照组。HBV-ACLF及CHB的诊断标准遵循2012年《肝衰竭诊疗指南》及2010年《慢性乙型肝炎防治指南》［6-7］。排除标准：已接受抗乙肝病毒治疗，重叠其他肝炎病毒（甲、丙、丁及戊型）和重叠HIV感染者，疑似肿瘤或确诊肿瘤患者，合并其他全身性疾病及孕妇等。入组后HBV-ACLF患者均采取以抗乙肝病毒为基础的内科综合治疗，其中17例患者接受拉米夫定（100 mg/d），26例患者采用恩替卡韦（0.5 mg/d）抗病毒治疗。NC组、CHB组及HBV-ACLF组间性别及年龄均无统计学差异（P=0.879及P=0.145），研究对象的一般临床资料见表1。

1.2 实验方法

1.2.1 Tc17细胞检测 取肝素纳抗凝血250 μL，加入佛波酯（25 ng/mL，美国Sigma公司）联合离子霉素（1 μg/mL，美国Sigma公司）刺激，置于37℃含CO2培养箱，1 h后加蛋白质转运抑制剂莫能霉素，继续培养4 h。收集细胞，加入APC标记的抗人CD8（20 μL，美国BD公司）及PerCP-Cy5.5标记的抗人CD3（20 μL，美国BD公司），室温避光反应30 min；加入固定液A液（100 μL，美国Invitrogen公司），室温反应15 min，离心去上清；后加入破膜液B液（100 μL，美国Invitrogen公司），同时加入PE标记的抗人IL-17（10 μL，美国eBioseience公司）或同型对照，室温避光反应30 min，离心去上清，采用BD FACS calibur流式细胞仪检测，用Cellquest软件进行数据分析。

1.2.2 肝功能及凝血功能 全自动生化仪OlympusAU 640（日本Olympus公司）检测肝功能。STA-Compact型全自动止血/血栓分析仪（法国STAGO公司）检测凝血功能。

1.2.3 HBV-DNA检测 采用实时荧光定量PCR扩增仪ABI5700检测HBV-DNA，检测下限为100U/mL。

1.2.4 肝炎病毒标记物检测 使用Abbott/AxSYM全自动免疫分析仪检测HBsAg、HBeAg及HBeAb等。采用雅培ARCHITECT系统检测丙肝抗体；戊肝诊断试剂盒由美国Genelabs公司提供。

1.2.5 评估HBV-ACLF患者病情严重程度指标目前 MELD（model for end-stage liver disease）、MELD-Na、CLIF-C ACLF（chronic liver failure consortium acute-on-chronic liver failure）及 AARC（APASL ACLF research consortium）评分广泛用于评估HBV-ACLF患者病情及预后［8］。计算方式如下：

表1 研究对象的一般临床资料Table 1 Characteristics of participants enrolled in the study

1.3 统计学分析

使用SPSS 20.0软件包进行统计学处理。符合正态分布的数据采用均数±标准差描述，两组比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，前后比较采用配对t检验；非正态分布的资料采用中位数（M）和四分位数间距描述，即P50（P25～P75），用秩和检验分析差异；率的比较采用卡方检验或Fisher′s精确概率检验；以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NC、CHB和HBV-ACLF组间Tc17细胞表达的比较

采用流式细胞术检测外周血Tc17细胞表达水平，发现3组间Tc17细胞表达的差异具有统计学意义（F=18.551，P＜0.001）；进一步分析发现HBV-ACLF中Tc17细胞水平%（2.17±1.61）显著高于CHB组%（1.34± 0.54，t=3.078，P=0.017）及NC组%（0.83± 0.31，t=5.166，P＜ 0.001；图1）。

2.2 Tc17细胞表达与疾病严重程度的关系

本研究采用相关分析，发现在HBV-ACLF患者中，Tc17细胞与AARC评分、MELD评分及MELD-Na评分均成正相关（r=0.504，P=0.001；r=0.417，P=0.005及r=0.382，P=0.012）；而与CLIF-C ACLF评分有相关趋势，但无统计学意义（r=0.294，P=0.055；表2）。依据欧洲肝病学会慢加急性肝衰竭协作组（EASL-CLIF）的标准，我们将患者分为符合EASL-CLIF标准组及不符合EASL-CLIF标准组，发现符合EASL-CLIF标准的患者Tc17细胞（中位数2.08%，n=25）明显高于不符合组（中位数1.18%，n=18，Z=3.755，P＜ 0.001）；同时依据AARC评分，将患者分为Ⅰ级%（0.88±0.43，n=7）、Ⅱ级%（2.22± 1.66，n=27）和Ⅲ级%（3.04 ± 1.44，n=9），发现随着病情进展，Tc17细胞表达呈阶梯型升高（GradeⅠvs.GradeⅡ，t=-3.131，P=0.001；Grade Ⅱvs.GradeⅢ，t=-2.375，P=0.016；图2），以上结果提示Tc17细胞与患者病情严重程度密切相关。

图1 三组间Tc17细胞的表达情况Fig.1 Expression of Tc17 cells in NC group，CHB group and HBV-ACLF group

表2 Tc17细胞表达水平与疾病严重程度密切相关Table 2 Tc17 cells were closely correlated with disease severity in HBV-ACLF patients

2.3 Tc17细胞的表达与HBV-DNA病毒下降的关系

免疫细胞介导的炎症反应是清除HBV-DNA病毒的关键。首先我们发现Tc17细胞的表达与基线HBV-DNA载量成正相关（r=0.339，P=0.026）；接着依据Tc17细胞表达水平（中位数1.84%），分为高表达组（Tc17≥1.84%，n=22）及低表达组（Tc17＜1.84%，n=21），发现高表达组的HBVDNA载量（5.57±1.28）明显高于低表达组（4.42±1.12，t=3.120，P=0.003；图3A）。我们比较4周后HBV-DNA下降情况（期间4例患者死亡，只有39例患者纳入分析），发现Tc17细胞高表达组HBV-DNA下降幅度明显高于较低表达组（2.64±0.93vs.1.64±0.69，t=3.814，P＜0.001；图3B、C），提示Tc17细胞高表达有助于清除乙肝病毒。

图2 HBV-ACLF中Tc17细胞表达与病情严重程度密切相关Fig.2 Tc17 cells were closely correlated with disease severity in HBV-ACLF patients

图3 Tc17细胞的表达与HBV-DNA清除有关Fig.3 HBV-DNA Elimination was associated with the expression of Tc17 cells

2.4 预测HBV-DNA清除的相关因素

我们采用线性回归分析方法寻找能够预测4周后HBV-DNA清除的相关因素。在单因素回归分析中，我们发现基线Tc17细胞水平、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、白蛋白、AARC评分、MELD评分、MELD-Na评分及肝硬化状态等可能是影响HBVDNA清除的重要因素；接着我们将上述指标纳入多因素线性回归分析，发现只有基线Tc17细胞水平（P=0.001）及谷草转氨酶（P＜0.001）与HBVDNA清除有关（表3）。

表3 与HBV-DNA清除的相关因素分析Table 3 Factors associated with the elimination of HBV-DNA in univariate and multivariate linear regression analysis

3 讨论

细胞毒性T细胞（cytotoxic T cells，CTL）是一组由幼稚CD8+T细胞活化而成的具有细胞毒性的效应细胞，在抗原提呈细胞的协同刺激下形成可以特异性杀伤靶细胞的效应细胞。依据分泌的细胞因子不同，经典的CTL可分为Ⅰ型及Ⅱ型细胞毒性T细胞。随着对IL-17的研究逐渐增多，学者们发现体内存在一群以分泌IL-17为特点的CD8+T细胞，命名为Tc17 细胞［9］。已发现Tc17 细胞在多种疾病中发挥着重要作用，但关于Tc17细胞在肝病领域的研究甚少。有研究表明Tc17细胞在慢性丙型肝炎患者肝内聚集，可能是导致丙型肝炎慢性化的重要原因之一［10］。在本研究中我们发现HBV-ACLF患者中Tc17细胞水平显著高于CHB患者和NC组，差异均具有统计学意义，初步提示Tc17细胞介导的炎症反应可能参与HBVACLF的发生发展。

已知免疫细胞介导的炎症反应是HBV-ACLF的核心发病环节，且过激的炎症反应是导致肝细胞大片坏死的关键［3-4］，因此我们推测Tc17细胞的表达可能与HBV-ACLF的病情严重程度有关。MELD及MELD-Na评分是临床上评估终末期肝病患者病情及预后的重要指标［11］，研究发现Tc17细胞与MELD评分及MELD-Na评分均成正相关（表2）。由于ACLF疾病的特异性，且欧美国家及亚太地区导致ACLF的主要病因不同（欧美地区主要为酒精性肝硬化，而亚太地区主要为HBV感染），随后各自建立了适合评估患者病情的模型，即CLIF-C ACLF评分（欧美国家）及AARC评分（亚太地区）［12-13］。在本研究中我们发现Tc17细胞与AARC评分成正相关（r=0.504，P=0.001），而与CLIF-C ACLF评分仅存在相关趋势。欧美国家主要是基于器官衰竭的类型及数量来诊断ACLF，因此相对而言，该标准要求更加严格；我们将患者分为符合标准及不符合组，发现符合欧美标准的患者Tc17细胞表达更高；更重要的是，我们发现随着AARC分级的增加，Tc17细胞的表达呈阶梯型升高，再次佐证Tc17细胞介导的炎症反应参与了HBV-ACLF的发生发展，且Tc17细胞的表达水平能够协助评估患者病情。

宿主的免疫细胞介导的炎症反应是清除乙肝病毒的关键。经典的CTL细胞可以通过IFN-γ、穿孔素等发挥抗病毒作用。已有研究报道Tc17细胞是一群低细胞毒性的CTL细胞，关于其在清除病毒方面的研究甚少。有研究报道在流感小鼠模型中，过继的Tc17细胞可通过Fas-FasL通路清除流感病毒，从而保护肺功能［14］，该研究提示Tc17细胞具有抗病毒作用。然而关于Tc17细胞在乙肝病毒清除方面的研究，目前尚未见报道。本研究发现基线HBV-DNA水平与Tc17细胞表达成正相关；我们进一步将患者分为Tc17细胞高表达组及低表达组，发现高表达组4周后HBV-DNA下降幅度明显强于较低表达组，提示Tc17细胞有助于清除HBV-DNA。

核苷类似物是当前常用且高效的抗乙肝病毒药物［15］。本研究中所有HBV-ACLF均接受抗乙肝病毒治疗，那么患者4周后HBV-DNA载量下降是抗病毒药物的作用抑或是炎症反应所致？将患者基线数据纳入回归分析，发现抗病毒治疗方案的选择（拉米夫定或恩替卡韦）并不是影响因素，这与我们的前期研究的结果是符合的［16］。而基线Tc17细胞表达水平及谷草转氨酶水平才是独立预测患者HBV-DNA下降的关键因素，表明Tc17细胞介导的炎症反应有助于清除乙肝病毒。但过激的炎症反应带来的组织损伤及病毒清除之间的关系及两者如何维持相对平衡，目前尚不清楚。另外本研究的样本数相对较小，且Tc17细胞的调节分化机制尚未明，需要纳入更多患者进一步验证及阐明相关机制。以上问题的解决，将有助于进一步揭示Tc17细胞在HBVACLF中的作用，为HBV-ACLF的防治提供新的靶点。

综上，Tc17细胞介导的炎症反应有助于清除乙肝病毒，但过激的炎症反应将导致病情进展，因此有必要动态监测Tc17细胞的变化，尽早选择合理的治疗方案。