基于QIAxcel毛细管凝胶电泳分析系统的7种猪病毒检测方法的建立与初步应用

邬旭龙，肖 璐，林 华，杨泽晓，姚学萍，王 印*，张鹏飞，姜睿姣

(1.四川农业大学动物医学院，四川成都611130；2.成都农业科技职业学院，四川成都611134；3.四川省畜牧科学研究院四川成都610066；4.成都海关，四川成都6l004l)

猪伪狂犬病毒(PRV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(CFSV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪圆环病毒2 型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及猪细小病毒(PPV)是猪呼吸与繁殖系统常见病原，且CSFV、PCV-2、PRRSV、PRV、PPV 能够引起免疫抑制，引起继发感染，加重病情、造成死亡，给猪场造成严重经济损失[1-3]。其中ASFV 于2018 年8月首次被报道传入我国，已蔓延超过20 省，其传染性强、致死率高，威胁巨大[4-5]。

QIAxcel 毛细管凝胶电泳(QIAxcel CGE Capillary gel electrophoresis，QIAxcel CGE)分析系统，是新一代的核酸片段分析系统[6]。在高压电场驱动下，各组分的分子大小、带电荷数、等电点等性质不同，从而形成不同迁移速率，各组分依次移动至毛细管输出端附近的光检测器[7]，检测和记录其吸光度，并将各组分以吸收峰的形式动态直观地记录下来，自动分析出各目的片段的碱基数，该技术的出现极大地简化了PCR 产物的分析步骤[8]、提高了检测效率，且分辨率可达3 bp～5 bp，优势突出。

本研究以多重PCR 为基础，并结合毛细管电泳建立了上述7 种病毒的新型检测平台，有效降低检测成本，提高检测效率，对毛细管凝胶技术在国内的发展，尤其是在动物疾病诊断中的发展奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 PRV (Bartha-K61 株、HB-98株活疫苗)、JEV(SA14-14-2 株活疫苗、HW1 株灭活疫苗)、CSFV(细胞源活疫苗)、PCV-2 (CP08 株、WH 株、ZJ/C 株灭活疫苗)、PRRSV (R98 株、JXA1-R 株灭活苗)、PPV (CP-99 株、WH-1 灭活苗)、猪O 型口蹄疫病毒(FMDV-O，O/GX/09-7 株+O/XJ/10-11 株)、猪流行性腹泻病毒(PEDV，华毒株）、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV，CV777 株)的核酸由本研究室提取自各疫苗。ASFV p72 质粒由InvitrogenTM合成。副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)、猪链球菌(Streptococcus suis，S.suis)菌株由四川农业大学动物检疫实验室分离保存。65 份经国标或行标检测为PRV、CSFV、JEV、PCV、PRRSV 或PPV 一种或多种病毒核酸阳性的临床样本均由四川农业大学动物医学院动检实验室保存、提供，样本包括脾脏、淋巴结、肾脏、肺脏、肝脏、流产胎等。

1.3 引物设计 从NCBI GenBank 中下载数株各病毒全基因序列，经DNAMAN、DNAStar 等软件分析，选取各病毒保守基因利用Oligo 7、Primer 5 等软件设计7 对特异性引物。选取非同源性序列，设计1 对通用引物并在各特异性引物的5' 端添加通用引物序列(表1)。

表1 引物信息Table 1 Primers information

1.4 各病原重组质粒的构建与鉴定 参考TIAN amp Virus DNA/RNA Kit 说明书，分别提取PRV、JEV、CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV 基因组核酸，并将RNA 反转录成cDNA。以DNA 或cDNA 为模板，分别进行单一PCR 扩增，反应条件：94 ℃3 min；94 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃45 s，34 个循环；72 ℃3 min。将各PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收纯化后分别克隆于pMD19-T 载体中，各阳性重组质粒由InvitrogenTM公司测序。

1.5 多重PCR 体系的建立和优化

1.5.1 反应体系及反应条件 多重PCR 采用25 μL反应体系，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，混合特异性引物3.5 μL，上下游通用引物各1 μL，模板3 μL，ddH2O 补足25 μL。反应程序：第一阶段：94 ℃3 min；第二阶段：富集和加标签阶段，94 ℃30 s，退火30 s，72 ℃1 min，10 个循环；第三阶段：指数扩增，94 ℃30 s，退火45 s，72 ℃1 min，34 个循环；第四阶段：72 ℃总延伸3 min。

1.5.2 退火温度及引物浓度的优化 在25 μL 反应体系优化中，控制变量单一，首先对靶序列富集阶段退火温度进行优化(50 ℃～60 ℃)，再保持其它条件一致，利用最优的靶序列富集阶段退火温度，对指数扩增阶段的退火温度进行优化(50 ℃～60 ℃)，每个退火温度梯度均设2 平行孔。采用最优的退火温度，预混14 条特异性引物使其体系浓度分别为：0.028 μmol/L、0.056 μmol/L、0.084 μmol/L、0.112 μmol/L、0.140 μmol/L、0.168 μmol/L、0.196 μmol/L、0.224 μmol/L、0.252 μmol/L、0.280 μmol/L，对特异性引物浓度进行优化，采用已确定最优的退火温度及特异性引物浓度，对通用引物浓度进行优化，使其体系终浓度分别为0.16 μmol/L、0.32 μmol/L、0.48 μmol/L、0.64 μmol/L、0.8 μmol/L、0.96 μmol/L、1.12 μmol/L、1.28 μmol/L、1.44 μmol/L、1.6 μmol/L，每孔均设2个复孔。根据不同条件下获得的平行孔中各靶序列荧光信号取平均值(四舍五入后)进行最优条件筛选，建立能够同时检测PRV、JEV、CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV 及ASFV 7 种猪病毒的多重PCR QIAxcel 毛细管凝胶电泳检测平台(PCR-QIAxcel)。

1.6 特异性试验 采用TIAN amp Virus DNA/RNA Kit 提取FMDV-O、PEDV、TGEV 各商品疫苗核酸，并反转录成cDNA；采用TIAN amp Bacteria DNA Kit，提取HPS、APP、S.suis细菌基因组核酸，将7种特异性病原与FMDV-O、PEDV、TGEV、HPS、APP、S.suis菌毒株的基因组混合，采用优化后的PCR-QIAxcel 进行特异性验证。判读标准为157 bp～162 bp 可判断为PRV，174 bp ～179 bp 可判断为CSFV，208 bp～213 bp 可判断为JEV，253 bp～258 bp可判断为PCV-2，301 bp～306 bp 可判断为PRRSV，351 bp～356 bp 可判断为PPV，336 bp～341 bp 可判断为ASFV。

1.7 灵敏度试验 利用超微量分光光度计测定7 种病毒重组质粒的浓度，并换算成拷贝数，对该7 种病毒的混合质粒10 倍倍比稀释，采用所建立PCR-QIAxcel 方法测定其最低检测限。

1.8 重复性试验 采用本实验建立的PCR-QIAxcel方法，以浓度均为105拷贝/μL 经混合的上述7 种重组质粒模板作为模板，设置3 个平行组，收集每组中所有目的条带对应碱基数的数值，分析其变异系数(CV)，评价该方法的重复性。

1.9 临床应用 采用所建立的方法，对临床采集保存的65 份临床样本进行PRV、 JEV、 CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV 及ASFV 7 种病毒的检测。同时参考国家推荐标准或行业推荐标准中检测方法(PRV：GB/T 18641-2002；JEV：GB/T 22333-2008；CSFV： GB/T 16551-2008； PCV-2： GB/T 21674-2008； PRRSV： GB/T 27517-2011； PPV： SN/T 1874-2007；ASFV：SN/T 1559-2010)，对65 份临床样品进行检测，并与PCR-QIAxcel 检测结果进行比较。

2 结 果

2.1 各病原重组质粒的构建与鉴定 对不同病原的核酸经单一PCR 扩增显示PRV、CSFV、JEV、PCV-2、PRRSV、PPV 扩增的目的条带分别为159 bp、177 bp、211 bp、254 bp、304 bp、353 bp，人工合成ASFV p72 质粒PCR 扩增可见340 bp 的目的条带(图1)。将各PCR 胶回收产物与pMD19-T 载体连接，经克隆、转化筛选出的阳性质粒进行测序，将结果与NCBI GenBank 中BLAST 比对显示，重组质粒中插入片段与各病原参考株的同源性均大于99%。表明PCR 扩增的基因片段均分别为各病毒的特异性片段，且各重组质粒均正确构建。

2.2 多重PCR 体系的建立和优化结果 经过反复优化，该PCR-QIAxcel 方法的最佳反应条件为：94 ℃3 min；94 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃60 s，10 个循环；94 ℃30 s，51 ℃45 s，72 ℃60 s，34 个循环；72 ℃总延伸3 min。最佳反应体系：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，混合特异性引物3.5 μL (终浓度为0.056 μmol/L)，混合通用引物2 μL (终浓度为0.64 μmol/L)，模板3 μL，ddH2O 补足25 μL。

图1 重组质粒的PCR 鉴定Fig.1 Identification of recombinant plasmids by PCR

2.3 特异性试验结果 采用建立的PCR-QIAxcel 进行特异性试验，结果显示仅有7 种特异性病原出现扩增信号峰值，且条带大小与预期相同，对照菌毒株均未见荧光信号峰(图2)，表明该方法能很好的扩增并区分不同的目标片段，具有较强的特异性。

图2 PCR-QIAxcel 特异性试验结果Fig.2 Cross-reactivity results of PCR-QIAxcel

2.4 灵敏度试验结果 采用7 对特异性引物和一对通用引物，对PRV、CSFV、JEV、PCV-2、PRRSV、PPV、ASFV 多重PCR 毛细管电泳检测的灵敏度进行测定，结果显示PRV、CSFV、JEV、PCV-2、PRRSV、PPV、ASFV 各质粒标准品的最低检测限分别为：4.56×103拷贝/μL、6.35×103拷贝/μL、1.98×103拷贝/μL、1.32×104拷贝/μL、3.21×103拷贝/μL、4.51×103拷贝/μL、3.37×103拷贝/μL。表明该多重检测方法灵敏度较高，最低检测限可达103拷贝/μL～104拷贝/μL，但比国标或行标里对应病毒单一PCR 检测方法的灵敏度略低。

2.5 重复性试验 采用本研究建立的PCR-QIAxcel进行重复性试验，结果显示，在3 次重复试验中，QIAxcel 系统对7 种PCR 扩增产物的条带大小判读稳定，各产物碱基数值的变异系数均小于1.0 %，表明该方法重复性较好。

图3 灵敏度试验结果Fig.3 Result of sensitivity test

表2 PCR 产物碱基数重复性试验结果Table 2 Repeatability results of base pair size of PCR products

2.6 临床应用 利用本研究建立的PCR-QIAxcel 对65 份临床样本进行检测，结果显示，以国标或行标单一PCR 检测方法为基准，65 份临床样本中有53份检出PRV、JEV、CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV中的一种或两种病毒核酸阳性，ASFV 未检出，该53 份阳性样本中，仅检出PRV、JEV、CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV、ASFV 中1 种病毒的样本数量为35 份，检出两种病毒的样本数量为16 份，检出3 种病毒的样本数量为2 份，两种或两种以上混合感染的样本检出率为34.0 % (18/53)。总体上看，PCR-QIAxcel 共检出47 份阳性样本，阳性样本的检出率为72.31 % (47/65)。在单一病原的检测中，PCR-QIAxcel 与国标、行标的单一PCR 检测方法的一致性为94.3 % (33/35)，而混合病原检测二者的一致性为77.7 % (14/18)。总体而言，两种方法的检测符合率为88.68 %。该临床样本检测结果表明，在单一感染的检测中，PCR-QIAxcel 与国标或行标中规定的单一PCR 检测方法相比，其一致性较高，但在多重感染的检测中，其检出率均低于单一PCR检测方法(表3)。表明PCR-QIAxcel 在临床样品检测中，尤其是混合感染样品的检测中，其检测灵敏度不及单一PCR。

表3 临床样本检测结果Table 3 Detection result of clinical samples

3 讨 论

QIAxcel CGE 系统在核酸检测中，尤其是对多重PCR 产物的检测中QIAxcel CGE 优势突出：第一，分辨率高、最低可对片段大小仅间隔3 bp～5 bp的产物进行辨别，且能够根据迁移时间和峰面积直接读出目的片段大小；第二，灵敏度高，核酸的最低检测限可达0.1 ng/μL；其三，高效快捷、操作性强，成熟的配套商品化试剂极大地简化了即用型预制卡夹的使用，省去了常规凝胶电泳配胶、制胶、上样、拍照等繁琐过程，12 个样本的电泳检测及分析仅需要约12 min；第四，安全环保，避免接触核酸染料、紫外光、电泳缓冲等有机废液，降低有毒有害物质对人及环境的危害。

多重PCR 的核心在于多对引物的设计，为保证其扩增效率，各PCR 产物大小宜控制在100 bp～400 bp 之内，这增加了引物设计的难度，导致PCR的“重数”越多、各目的条带的大小越接近，从而使得普通的凝胶电泳越难以对各目的片段进行很好地区分[9]。而将多重PCR 与QIAxcel CGE 联用，便能很好地解决因目的条带大小过于接近所导致的普通凝胶电泳难以分开的难题，且检测时长也大大缩短，与常规凝胶电泳相比，电泳时间缩短三分之二，检测效率大幅提高，QIAxcel CGE 在PCR 产物的快速筛查中发展潜力巨大。本研究在靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)技术的基础上进行改进[10-11]，针对每一个靶序列，仅采用一对带标签序列的特异性引物进行靶序列富集，结合QIAxcel CGE 系统，建立了能够同时检测PRV、CSFV、JEV、PCV-2、PRRSV、ASFV、PPV 7 种猪病毒的多重检测平台。

多重PCR 体系中特异性引物浓度极低，在反应的前10 个循环便被耗尽，使得第二扩增阶段体系中仅由通用引物进行扩增，减少了引物之间的非特异性结合，提升了扩增效率，提高灵敏度。本研究所建立的PCR-QIAxcel 对各病原质粒标准品的最低检测限为103拷贝/μL～104拷贝/μL，与其它常见的猪病毒或细菌性病源均未出现交叉反应，多重PCR 扩增稳定、重复性高，QIAxcel CGE 系统对目的条带大小判读结果的变异系数均小于1 %。该方法特异、灵敏、高效、稳定、安全且简洁，实现了多病毒在单管中同时检测，在高通量检测中意义深远，但在混合病原的检测中，PCR-QIAxcel 检出率低于单一PCR，究其原因主要在于多重检测体系中引物多、扩增片段多，在扩增过程中，不同引物与引物之间、引物与其非靶片段之间、靶片段与靶片段之间难免会相互产生一定的干扰，而这些无法完全规避的干扰使得多重检测的检出率低于单一检测。要提高多重检测方法的灵敏度，可从以下几方面进行：第一，在采集组织样品时，应选取多种不同脏器并将其混合后提取核酸进行检测，以降低因不同病原在猪体内各器官中分布和含量的差异而导致的灵敏度下降；第二，尽量采集新鲜的组织样品并及时检测，以求获取更准确的检测结果；第三，严格规范组织样品核酸提取过程，以免不规范操作导致核酸降解而影响检测结果。

本研究建立的多重检测技术快速、简便、自动化程度高，结果判读直接、方便，无需以琼脂糖作支持介质，省去制胶、拍照等繁琐过程，极大地简化了分析步骤、提高检测效率，并且安全，快捷，在高通量检测体系中应用潜能巨大。但QIAxcel CGE 系统也存在一些不足，例如对PCR 产物判读存在3 bp～5 bp 的误差，尤其是浓度较高的目的片段误差最大可达8 bp～10 bp，这会对结果判定有一些影响，尤其是对碱基数相差较小的目的片段的判定，同时，这给PCR 扩增体系建立提出了新的挑战，要求在保证检测灵敏度的前提下，应尽量调整各引物对浓度，使其扩增效率差异最低，以呈现最准确的结果。