一种广谱、低毒的抗菌肽类似物HJH-3的生物学活性和膜活性的测定

王 青，徐彦召，杨 磊，董萌萌，白跃宇，赵 坤，胡建和*，张文举

(1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子832003；2.河南科技学院动物科技学院，河南新乡453003)

抗生素耐药菌株、“超级细菌”的出现对世界公共卫生造成了严重的威胁；研究发现耐药基因可以在细菌之间发生交换，导致更多耐药菌株的出现，加剧了细菌对动物和人类健康的危害[1-2]。传统抗生素通常通过干扰或阻断细菌正常的代谢过程杀灭细菌；然而，细菌往往可以通过改变遗传结构和抗生素靶标位点，避免或抵抗抗生素的作用[3]。抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMPs)是机体先天免疫系统的组成部分，伴随着不断从各种生物体和组织中分离和鉴定出新的AMPs，研究人员研究了AMPs的结构与活性之间的关系[4]。虽然它们的作用方式尚未完全被熟知，但被广泛认可的作用机制是它们以细菌的细胞质膜为靶目标，通过静电相互作用吸附在脂质双层上。AMPs 以低聚体的形式插入细菌细胞膜，从而形成跨膜通道，最终破坏细菌的细胞膜。由于膜是细胞存活的重要屏障，并且膜的完整性对于细菌的生长至关重要，AMPs 通常通过该种方式杀死细菌[5]。因此，细菌对AMPs 不易产生耐药性。但AMPs 的抗菌活性与溶血性之间存在一定相关性，抗菌活性越好，对细胞毒性就越大[6]。因此，需要寻找具有良好抗菌活性且低细胞毒性的AMPs 替代传统抗生素。相关报道显示，整个血红蛋白分子不具有抗菌活性，但一些血红蛋白片段有抗菌活性[7]。本实验室前期从牛红细胞的血红蛋白α 亚基中分离得到了AMPs P3[8]，本研究检测了P3类似物HJH-3 的抗菌活性，且观察了HJH-3 对细菌形态学的影响，测定了HJH-3 对细菌跨膜电位的影响，从而阐明了HJH-3 的破膜机理，为AMPs 的开发应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 AMPs 与菌种 P3 类似物HJH-3[8]由本实验室合成；AMPs Pexiganan 购自吉尔生化(上海)有限公司。大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC25922 株、大肠杆菌临床分离株、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC29213 株、金黄色葡萄球菌临床分离株、 鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)BNCC124693 株、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhoid)CVCC541 株、沙门氏菌(Salmonell)临床分离株和白色念珠菌(Canidia Albicans)ATCC90029 株均由本实验室保存。

1.2 主要实验材料 TSB 培养基和Sabouraud's agar培养基购自上海创赛科技有限公司；Triton X-100、PI、双-(1，3- 二丁基巴比妥酸)三甲胺肟醇[DiBAC4(3)]均购自宝生物工程(大连)有限公司；琼脂糖购自基因集团上海贝晶生物技术有限公司。固相多肽合成仪为美国GENE Tribute 公司产品；超高效液相色谱质谱联用仪为美国Waters 公司产品。

1.3 AMPs HJH-3 的合成与纯化 根据AMPs HJH-3 已知的氨基酸序列：VNFKLLSHSLLVTL RSHL，利用在线ProtParam 软件对AMPs HJH-3 进行理化性质信息的分析；利用ProtScale 在线软件对AMPs HJH-3 进行疏水性预测；利用9- 芴甲氧羰基(F-moc)固相化学合成法通过多肽合成仪制备AMPs HJH-3 (VNFKLLSHSLLVTLRSHL)。用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对所制备的肽进行纯化，纯度≥95 %；再利用质谱仪测定合成物质的分子质量。

1.4 AMPs HJH-3 最小抑菌浓度(MIC)的测定 分别挑取待测的大肠杆菌(ATCC25922)、临床大肠杆菌、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、临床金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门氏菌、临床沙门氏菌和白色念珠菌(ATCC90029)的单菌落，按照CLSI 标准[9]操作，检测AMPs HJH-3 对上述各种菌的抑制作用。

1.5 AMPs HJH-3 溶血活性的检测 采集兔耳静脉血液，800 r/min 离心5 min，弃去上清液，分离红细胞。将分离的红细胞用生理盐水洗涤3 次至上清液透明，制得红细胞悬液。将AMPs HJH-3 溶液与5%(V/V)红细胞悬液等体积混合，37 ℃孵育1 h。用1%Triton X-100 处理的红细胞作为阳性对照(100%溶血)；未经AMPs 处理的红细胞作为阴性对照(无溶血)。通过测定红细胞在OD414nm处的吸光度来检测AMPs HJH-3 溶血活性。并与商品化的AMPs Pexiganan 的溶血活性进行比较。计算方法为(OD414nm肽-OD414nm阴性对照)/(OD414nm阳性对照-OD414nm阴性对照)。

1.6 AMPs HJH-3 稳定性的测定 以大肠杆菌ATCC25922 株为试验菌株，采用琼脂糖扩散法[10]，将浓度为1 mg/mL 的AMPs HJH-3 分别在0、20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃和100 ℃下孵育20 min，测定AMPs HJH-3 的热稳定性；将浓度为1 mg/mL 的AMPs HJH-3 在pH 分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 的LB 培养基中孵育20 min，测定AMPs HJH-3 的酸碱耐受性；将浓度为1 mg/mL的AMPs HJH-3 分别在250 mmol/L、200 mmol/L、150 mmol/L、100 mmol/L、50 mmol/L 的NaCl 溶液中孵育20 min，测定AMPs HJH-3 的离子强度稳定性。在加入覆盖琼脂糖之前，立即使用游标卡尺测量所有样品的初始直径(Do)。培养24 h 后，用游标卡尺测量生长抑制区的直径(Di)。所得抑制率(Di-Do)反映了AMPs HJH-3 的稳定性。

1.7 AMPs HJH-3 对膜电位影响的检测 将对数生长期的大肠杆菌ATCC25922 株和金黄色葡萄球菌ATCC29213 株分别与5 mmol/L 的DiBAC4(3)在37 ℃的HEPES 溶液中孵育40 min，将终浓度为50 μg/mL AMPs加入到上述悬浮液中。不加抗菌肽的上述悬液为阴性对照。使用酶标仪以30 s 的时间间隔收集荧光强度数据，测定AMPs对细胞膜电位的影响。

1.8 AMPs HJH-3 对细菌膜通透性影响的检测将对数生长期的大肠杆菌ATCC25922 株和金黄色葡萄球菌ATCC29213 株分别与50 μg/mL 的AMP-sHJH-3 混合，在37 ℃孵育30 min；阴性对照组为细菌与PBS 混合，其它条件相同。将PI(100 μg/mL)添加到所有样品中，并将悬浮液在37 ℃孵育10 min，荧光显微镜下观察样品。通过测量细菌对PI 的吸收来测定膜渗透性。

1.9 AMPs HJH-3 对细菌形态的影响 将经过磷酸盐缓冲液洗涤的大肠杆菌ATCC25922 株和金黄色葡萄球菌ATCC29213 株(106cfu/mL)分别与HJH-3 混合后在37 ℃培养1 h，洗涤并收集菌体，采用2.5%(v/v)戊二醛固定3 h，将细菌滴加到直径为8 mm 的盖玻片上，依次在30%、60%、70%、80%、90%和100 %、100 % (v/v)乙醇中梯度脱水各15 min 后在冷冻干燥仪中干燥，按常规操作，通过扫描电子显微镜观察。同时，收集用HJH-3 处理过的上述两种细菌，经固定、脱水、浸透、包埋、修块、切片、电子染色等步骤，通过透射电子显微镜观察。

2 结 果

2.1 AMPs HJH-3 的合成与纯化 通过在线Prot-Param 软件和ProtScale 软件分别对AMPs HJH-3 进行理化性质分析和疏水性预测，结果显示，AMPs HJH-3 的分子式为C96H161N27O24，含有18 个氨基酸残基，由9 种基本氨基酸组成，分子量为2 027.44 Da。带正电荷的残基(Arg+Lys+His)数有2 个，不含带负电荷的残基(Asp+Glu)；其半衰期：在哺乳动物、网状细胞(体外)中大于100 h，在酵母(体内)中为20 h以上，在大肠杆菌(体内)中为10 h 以上；AMPs HJH-3 的不稳定指数为18.42，脂溶性指数(Aliphatic index)为162.22，表明HJH-3 是一种稳定性较好且耐热的AMPs。对合成的AMPs HJH-3 采用反相高效液相色谱法进行纯化，纯度为95 % (图1)，再利用质谱仪测定了HJH-3 的分子量，分别在693.14 Da和1039.56 Da 的+3 和+2 电荷态出现两个主要峰(图2)，表明合成的HJH-3 与预期分子质量一致。

图1 RP-HPLC 纯化AMPs HJH-3Fig.1 Purification of antimicrobial peptide HJH-3 by RP-HPLC

2.2 AMPs HJH-3 的MIC 测定结果 按照CLSI 标准[11]分别检测了 AMPs HJH-3 对大肠杆菌(ATCC25922)、临床大肠杆菌、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、临床金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门氏菌、临床沙门氏菌和白色念珠菌(ATCC90029)的MIC，结果显示，AMPs HJH-3 在6.25 μg/mL～50 μg/mL范围内，对上述各菌均有抑制作用(表1)。表明HJH-3 是一种广谱的AMPs，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌均有不同程度的抑制作用。

图2 质谱检测AMPs HJH-3Fig.2 Analysis of antimicrobial peptide HJH-3 by mass spectrometry

表1 AMPs HJH-3 对各菌株的MIC 检测结果Table 1 MIC test results of antimicrobial peptide HJH-3 against representative strains

2.3 AMPs HJH-3 溶血活性的检测 利用制备的红细胞悬液与HJH-3 溶液共孵育，通过测定红细胞在OD414nm处的吸光度来检测AMPs HJH-3 的溶血活性。结果显示，即使在400 μg/mL (大于5 MIC)条件下作用1 h，AMPs HJH-3 的溶血率仍低于10 %；而商品化的AMPs Pexiganan 在100 μg/mL 时，其溶血性率为45.4 %，在400 μg/mL 时，其溶血率为56.9 % (图3)。表明抗菌肽HJH-3 对兔红细胞的溶血活性较低、毒性小。

图3 AMPs HJH-3 的溶血性检测Fig.3 Hemolytic effects of the antimicrobial peptide HJH-3

2.4 AMPs HJH-3 稳定性的测定结果 以大肠杆菌ATCC25922 株为试验菌株，采用双层琼脂扩散法[12]，测定AMPs HJH-3 分别对不同的温度、酸碱度和离子强度的耐受性。结果显示，HJH-3 在不同温度下处理30 min，抗菌活性随温度的升高而降低，但其在100 ℃处理30 min 后仍具有较好的抑菌活性(图4A)；HJH-3 在pH 值为7 时具有最强的抗菌活性，当pH 值为4～7 和7～10 时仍具有抗菌活性(图4 B)；当NaCl 溶液的浓度略大于或小于0.9 % (W/V，154 mmol/L)时HJH-3 的活性略降低(图4 C)。由此表明，AMPs HJH-3 具有较好的热稳定性，在较宽的酸碱度范围内均可以发挥抗菌作用，离子浓度对HJH-3 的活性没有明显的影响。

图4 AMPs HJH-3 的稳定性检测Fig.4 Stability tests of the antimicrobial peptide HJH-3

2.5 AMPs HJH-3 对膜电位影响的检测结果 将对数生长期的大肠杆菌ATCC25922 株和金黄色葡萄球菌ATCC29213 株分别与5 mmol/L 的DiBAC4(3)混合孵育40 min 时加入AMPs，测量其荧光强度，结果显示，当加入HJH-3 时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的荧光强度立即增加，而不加AMPs 的对照组则维持固定的膜电位(图5)。表明AMPs 能够使细菌细胞膜迅速去极化，从而破坏了膜的完整性。

图5 AMPs 作用细胞后细胞膜去极化检测Fig.5 Depolarization effects on cell membrane upon action of antimicrobial peptides

2.6 AMPs HJH-3 对细菌膜通透性影响的检测结果测定 将对数生长期的大肠杆菌ATCC25922 株和金黄色葡萄球菌ATCC29213 株分别与50 μg/mL 的AMPs HJH-3 混合后于荧光显微镜下观察，结果显示，与AMPs 作用后的大肠杆菌(图6A)和金黄色葡萄球菌(6 C)均产生了红色荧光，而未与AMPs 作用的大肠杆菌(图6B)和金黄色葡萄球菌(图6D)均无荧光产生。表明AMPs 破坏了细菌细胞膜的完整性。

2.7 AMPs HJH-3 对细菌形态的影响 将经过抗菌肽HJH-3 处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌经扫描电子显微镜观察可见，HJH-3 能够穿透大肠杆菌的膜，形成许多“孔洞”(图7B)。对于金黄色葡萄球菌，HJH-3 能够使其细胞受损、黏连(图7D)。阴性对照组大肠杆菌(图7A)和金黄色葡萄球菌(图7C)细胞表面光滑、结构完整。

同时，收集HJH-3 作用后的上述两种细菌，利用透射电子显微镜观察可见，大肠杆菌(图8B)和金黄色葡萄球菌(图8D)的细胞膜出现了明显的破损，细胞内容物释放出来。未经HJH-3 处理的大肠杆菌(图8A)和金黄色葡萄球菌(图8C)细胞表面光滑完整，细胞内结构完整。

图8 AMPs HJH-3 作用后细菌透射电镜检测Fig.8 TEM micrographs of bacterial cells treated with antimicrobial peptides HJH-3

上述两种试验方法均表明，AMPs HJH-3 能够破坏细菌细胞膜的完整性，导致细菌变形、破裂、黏连，从而对细菌产生抑制、杀灭作用。

3 讨 论

AMPS 是传统抗生素的替代物。然而，许多天然的AMPs 均是小分子物质，尽管多肽合成技术已经比较成熟，但在实验过程中其主要由试剂公司合成，合成成本相对较高，交货时间也比较长，从而限制了其临床应用。本研究所选取的HJH-3 是一种分子量为2.02 ku 的碱性肽，含有18 个氨基酸，由本实验室人员通过软件分析氨基酸合成的难易程度，合理安排氨基酸羧化反应的时间，使用所拥有的全自动多肽合成仪自主合成，从而降低了研究成本，节约了时间。

AMPs 对微生物的抑制作用可以通过多种模式实现，但目前得到广泛认可的是AMPs 的细胞作用机制。研究者归纳了AMPs 的4 种不同的膜作用模型，如：板- 桶模型、环形孔模型、地毯模型、凝聚模型等。其中，“板-桶模型”膜作用机制认为：带正电荷的抗菌肽，首先通过静电吸引作用聚集在细胞膜表面，并在细胞膜上堆积形成多聚体；其次，AMPs 聚集体的疏水基团嵌入细胞膜的磷脂双分子层中形成跨细胞膜通道，细胞膜的完整性被破坏；最后，细胞内外渗透压发生改变或者细胞内容物泄露等情况，最终细胞崩解死亡。研究证实AMPs Hf-1、AMPs SK84、AMPs Ctx-Ha 等均采用该种模式起到杀菌作用[13-14]。“环形孔模型”认为：AMPs 分子可以不通过静电吸引作用即可以插入细菌的细胞膜内(同时改变细胞膜的表面张力)，形成环孔状通道贯通外脂质双层分子，最终导致靶细菌的死亡。研究证实，Magainins、Protegrins 和蜂毒素Melittin 是通过“环孔”模型发挥杀菌作用的[15-16]。“地毯模型”指出，抗菌肽首先以“平铺”的形式分布于细菌细胞膜表面，并逐步堆集致使细菌细胞膜表面张力发生改变，最终导致细胞膜出现破裂。抗菌肽Dermaseptin、 Bactenecin 、Aurein 1.2 、Cecropin P1 均是采用该种作用模式[17-18]。“凝聚模型”指出，AMPs 以分子团的形式聚在细胞膜的表面，并与细胞膜上磷脂分子形成肽- 脂质分子复合物，膜两侧由于电势差的存在而逐渐形成跨膜孔洞，最终导致靶细菌死亡。AMPs HJH-3 作用细菌的膜电位监测结果显示，带有正电荷的抗菌肽HJH-3 作用细菌后，可以迅速导致细菌的去极化；膜通透性结果显示，不能透过完整细胞膜的PI 染料可以和细菌胞内DNA 结合，说明细菌在HJH-3 的作用下，细胞膜的通透性发生改变；扫描电镜确认了AMPs 可以造成细菌细胞膜表面出现孔洞或裂隙，透射电子显微镜进一步确认了细菌细胞膜的裂解；由以上结果可以推测，AMPs HJH-3 对细胞的破坏作用可能是采用“板-桶模型”作用于细菌的细胞膜。

本研究同时发现，HJH-3 不仅抗菌活性较高，同时对红细胞的毒性较低，这可能与其特殊的氨基酸序列有关。通过分析，在牛红细胞血红蛋白α 亚单位的同一区域与人和猪的氨基酸具有高度同源性[14]。同时，HJH-3 肽链总体趋向于亲水性。因此，HJH-3寡聚体与红细胞膜的结合较弱，从而对红细胞的毒性较低。

本研究初步探明了AMPs HJH-3 抑菌作用机制，证实了AMPs HJH-3 可以破坏细菌膜的完整性从而表现出较强的抗菌活性，同时该AMPs 稳定性好，溶血作用较弱。由此推测HJH-3 作为一种新的抗菌剂具有广阔的应用前景，从而为AMPs 的开发利用奠定了理论基础。