鸭瘟病毒疫苗株UL44.5和UL44基因间隔区作为复制非必需区的鉴定

赵玉博，陈普成，胡玉珍，丁蕾蕾，王 波，焦晨晨，姜永萍，陈化兰，柳金雄

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/ 农业部动物流感重点开放实验室，黑龙江哈尔滨150069)

鸭病毒性肠炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)又称鸭瘟病毒，属疱疹病毒，其基因组庞大，可供外源基因插入的复制非必需区多，是良好的活病毒载体[1]。

关于DEV 基因组复制非必需区的已有研究表明，UL27 与UL26 之间、LORF11 与UL55 之间、SORF3 与US2 之间和US7 与US8 之间的相关位点可以作为良好的外源基因插入位点[2-3]。因此，本实验室前期在DEV 基因组US7 与US8 之间发现适合外源基因插入的位点，并构建出可作为疫苗株的重组病毒[4]。

反向遗传操作技术可以在DNA 或RNA 水平对病毒基因进行修饰和改造，然后通过拯救出病毒的表型变化来判断基因操作的效果，从而对病毒基因组表达调控机制、病毒致病的分子机理等进行研究[5-6]。

探寻DEV 基因组中可供外源基因插入的位点具有重要意义。为了探索其更多可利用位点，本研究利用反向遗传技术，筛选到DEV 基因组复制非必需区适合外源基因插入的位点，为构建以DEV 为载体的疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 DEV 拯救系统的5 个粘粒(即pFosT、pFosH、pFosJ、pFosQ、pFosD)和重组质粒pENTR-SV40 由本实验室构建并保存；DEV AV1222疫苗株购自中国兽医药品监察所；DEV AV1221 强毒株购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)；9 日龄～10 日龄SPF 鸡胚和实验所用的SPF 鸭均由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1.2 主要试剂表达红色荧光蛋白(RFP)的pDsred2-N1 质粒购自Clontech 公司；含有CCDB 基因的Gateway 试剂盒购自Invitrogen 公司；Q5 High-Fidelity DNA Polymerase、T4 Polynucleotide Kinase、SbfⅠ限制性内切酶、T4 DNA Ligase 均购自NEB 公司；DL2000、DL5000 DNA Marker 购自TaKaRa 公司；Plasmid Midi Kit 购自Qiagen 公司；胶回收试剂盒购自Omega 公司；转染试剂TransIT-X2 Dynamic Delivery System 购自Mirus 公司；DH5α 感受态细胞、病毒DNA 提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 重组质粒pENTR-SV40-RFP 的构建 根据RFP 基因(M96064.1)，设计扩增引物RFP-F/R(表1)，本实验所用引物均由擎科生物技术有限公司合成。以pDsred2-N1 为模板，采用引物RFP-F/R 扩增含有RFP 的目的基因。PCR 反应条件为：98 ℃30 s；98 ℃10 s、56 ℃30 s、72 ℃2 min，35 个循环；72 ℃2 min。胶回收纯化后即获得含有RFP 的目的基因。利用EcoR V 酶切后将其连接至pENTR-SV40 质粒中，构建重组质粒pENTR-SV40-RFP。以RFP-F/R为引物，通过PCR 和测序鉴定该重组质粒。

1.4 重组粘粒pFosD-RFP 的构建 以含有CCDB基因的质粒为模板，采用引物CCDB-F/R (表1)进行PCR 扩增。PCR 反应条件为：98 ℃30 s；98 ℃10 s、56 ℃30 s、72 ℃2 min，35 个循环；72 ℃2 min。胶回收纯化后即得到含有CCDB 的表达框。参照Gateway 系统的操作说明，先用E/T 克隆将该CCDB表达框插入到粘粒pFosD 基因组中，插入位点位于DEV 基因组UL 区的UL44.5 和UL44 的复制非必需区之间，得到含有CCDB 的重组粘粒pFosD-CCDB。利用LR 克隆技术将构建好的重组质粒pENTRSV40-RFP 与重组粘粒pFosD-CCDB 进行反应，得到含有RFP 的重组粘粒pFosD-RFP。通过PCR 方法和测序验证重组粘粒pFosD-RFP 的构建是否正确。

1.5 重组病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 的拯救及遗传稳定性的鉴定 利用SbfⅠ限制性内切酶将pFosT、pFosH、pFosJ、pFosQ 和pFosD-RFP 等5 个粘粒线性化处理，使用酚-氯仿方法回收酶切后的DNA 产物，参照磷酸钙转染方法分别将5 个线性化粘粒共同转染次代鸡胚成纤纬细胞(CEF)，连续传至第10代，并且连续观察红色荧光表达情况。利用病毒DNA 提取试剂盒分别提取第5 代、10 代重组病毒感染CEF 细胞的总DNA，采用插入到DEV 基因组两侧的位点鉴定引物UL44.5-F/UL44-R (表1)进行PCR 扩增，鉴定重组病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 拯救情况及遗传稳定性。

1.6 重组病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 的生长曲线滴定 将重组病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 和亲本DEV 疫苗株以MOI 0.01 的剂量分别接种次代CEF，分别于接种24 h、48 h、72 h、96 h 后收集细胞和上清，完全冻融一次，充分震荡混匀后离心，取上清滴加于96 孔板中，待5 d～6 d 后计算出每个时间点各病毒的TCID50。利用GraphPad 软件制作重组病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 和野生型DEV 在CEF 中的生长曲线，并对重组病毒在CEF 中的增殖情况进行分析。

表1 引物序列Table1 Primer sequence

1.7 重组病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 免疫效力评价将2 周龄SPF 鸭分为3 组，8 只/ 组。第一组以105TCID50/ 只重组病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 进行免疫；第二组以105TCID50/只免疫DEV 疫苗株，作为阳性对照组；第三组免疫PBS (0.2 mL/只)，作为空白对照组(Mock-Con)。免疫14 d 分别用100LD50的DEV AV1221 株强毒攻击。攻毒后连续观察14 d，记录各组鸭发病和死亡情况。

2 结 果

2.1 重组质粒pENTR-SV40-RFP 的构建与鉴定使用引物RFP-F/R 对构建的重组质粒pENTRSV40-RFP 进行PCR 鉴定，扩增产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，经扩增得到约1 600 bp的目的条带，大小与预期相符(图1)，测序结果也与预期相符。表明重组质粒pENTR-SV40-RFP 正确构建。

图1 重组质粒pENTR-SV40-RFP 的PCR 鉴定Fig.1 Amplification of pENTR-SV40-RFP by PCR

2.2 重组粘粒pFosD-RFP 的构建与鉴定 对构建的重组粘粒pFosD-RFP 进行PCR 鉴定，扩增产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，经扩增得到约1 600 bp 的目的条带，大小与预期符(图2)，测序结果也与预期相符。表明重组粘粒pFosD-RFP 正确构建。

图2 重组质粒pFosD-RFP 的PCR 鉴定Fig.2 Amplification of pFosD-RFP by PCR

2.3 重组病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 的拯救 将pFosT、pFosH、pFosJ、pFosQ 和pFosD-RFP 5 个重组粘粒线性化后共转染次代CEF 中5 d 后，利用倒置荧光显微镜观察可见1 代、5 代、10 代重组病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 均有红色荧光(图3)，表明获得遗传稳定的重组病毒rDEV-ul44.5ul44RFP。

图3 重组病毒荧光表达情况Fig.3 Identification of recombinant viruses

分别提取第5 和10 代重组病毒细胞总DNA，利用引物UL44.5-F/UL44-R 经插入外源RFP 表达框的PCR 鉴定，结果显示两个代次重组病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 泳道均出现特异性的约1 600 bp 的目的条带，对照组野生型DEV 中两位点的泳道出现约300 bp 的条带(图4)。表明外源RFP 表达框插入DEV 基因组的UL44.5 和UL44 之间，并正确表达且稳定存在。

图4 重组病毒的PCR 鉴定结果Fig.4 Identification of recombinant viruses by PCR

2.4 重组病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 生长曲线滴定结果 将rDEV-ul44.5ul44RFP 和DEV 以MOI 0.01的剂量接种CEF，接种后每隔24 h 滴定其TCID50，并绘制其生长曲线。结果显示，该重组病毒和亲本DEV 在CEF 中的复制无显著性差异(图5)，表明在DEV 基因组UL44.5 和UL44 之间插入外源基因后，外源基因可以正确表达，且对重组病毒在细胞中的生长无明显影响。

图5 重组病毒和DEV 在CEF 中的生长曲线Fig.5 Growth curve of the recombinant viruses and DEV in CEF

2.5 重组病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 免疫效力评价结果 将DEV 疫苗株和重组病毒rDEV-ul44.5 ul44RFP 分别以105TCID50免疫SPF 鸭，免疫后2 周利用DEV 强毒攻击。结果显示， DEV 疫苗株、重组病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 均能够对DEV 强毒攻击的SPF 鸭提供100 %保护；空白对照组(Mock-Con)SPF 鸭发病率死亡率均为100 % (图6)。表明利用反向遗传操作技术构建的重组DEV 具有良好的免疫原性，DEV 基因组UL 区的UL44.5 和UL44 之间可以用作构建表达外源基因重组病毒的理想位点。

图6 重组病毒免疫后对DEV 强毒攻毒的保护效力Fig.6 Protective efficacy of the recombinant viruses against DEV

3 讨 论

DEV 弱毒活疫苗自60 年代以来在多个国家广泛使用，对预防DEV 具有良好的保护效果。DEV作为理想的重组病毒载体，具有免疫后几小时即可产生坚实的免疫保护，且不受母源抗体的干扰[7]。随着近些年基因组序列和基因功能研究的不断深入，以DEV 为载体表达其它抗原的疫苗研究报道逐渐增多[8-11]，该策略主要是通过筛选DEV 复制非必需区进行外源基因的表达，从而构建重组病毒，并通过相关评价确定其作为疫苗候选株的可行性。

相关研究者将1 型和3 型鸭肝炎病毒表达VP1蛋白的基因通过2A 序列串联后，插入DEV C-KCE株UL27 与UL26 基因之间，构建的重组疫苗rC-KCE-2VP1 能够产生快速的免疫反应[12]。Wang 等利用细菌人工染色体(BAC)技术，将H5N1 亚型禽流感病毒HA 基因插入DEV C-KCE 株UL55 基因内部构建得到重组疫苗[13]。胡玉珍等获得了DEV 两个可供外源基因插入的复制非必需区，分别位于us7基因内部、us8 和us1 基因之间，并构建了两株重组病毒[14]。本研究构建了重组病毒rDEV-ul44.5 ul44RFP，病毒经过连续传代至第10 代，经鉴定表明外源基因在该位点可以稳定遗传；表达的红色荧光表明，插入的RFP 基因能够稳定表达；重组病毒在CEF 中的生长曲线显示，该株重组病毒的生长特性与DEV 疫苗株无显著差异，说明外源RFP 基因的插入不影响重组病毒的增殖特性。重组病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 以105TCID50免疫SPF 鸭，攻毒保护结果显示，SPF 鸭在免疫14 d 后均能够诱导对DEV 强毒攻击的保护，保护效率均为100 %。这些结果表明，UL44.5 和UL44 基因间隔区是DEV 基因组的一个复制非必需区。鸭瘟病毒UL44 位于鸭瘟病毒基因组UL 区，其ORF 长1 296 bp，编码431个氨基酸的glycoprotein C (gC)。gC 能够免与补体C3b 受体片断结合，参与免疫逃避过程，抑制补体的激活途径，保护病毒不被抗体和补体中和。DEV UL44.5 基因的ORF 长813 bp，编码270 个氨基酸的蛋白。关于新位点插入外源RFP 基因是否干扰其两侧UL44.5、UL44 和病毒其它基因的功能性表达有待于进一步研究。

本研究鉴定出UL44.5 和UL44 基因间隔区是DEV 基因组的一个复制非必需区，更加完善了DEV 基因组的信息，同时为利用该位点构建以DEV 为载体的疫苗奠定基础。