王少霞
(河南科技大学第三附属医院心内科,河南 洛阳 471003)
长链非编码(Lnc)RNA是一类不同的非蛋白质编码转录物,在各种生物过程中发挥重要作用〔1,2〕。由LncRNA调节的这些生物学过程包括侵袭、转移、细胞凋亡、血管生成、microRNA沉默、胚胎发育、心脏衰老和肿瘤发展〔3~6〕。有研究报道,LncRNA UCA1通过抑制p27表达促进心肌细胞凋亡〔7〕。IncRNA H19是一种从H19基因转录的LncRNA,在胎儿的几种组织中高表达,但出生后表达显著降低〔8,9〕。有研究报道了H19相互矛盾的功能,特别是在癌症中〔10~12〕。H19在细胞损伤中的作用研究有限,其在大鼠血管平滑肌细胞损伤后表达异常,但在心肌细胞损伤中的作用及机制尚未清楚。本研究拟以脂多糖(LPS)诱导的心肌细胞H9c2为研究对象,检测过表达H19、敲减miR-194-5p、过表达miR-194-5p对H9c2细胞炎症因子分泌的影响。
1.1材料 心肌细胞H9c2购自ATCC;噻唑蓝(MTT)、脂质体LipofectamineTM2000、逆转录试剂盒、膜联蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)双染色法凋亡检测试剂盒购于Takara公司;DMEM培养基、胎牛血清均购自美国Sigma公司;肿瘤坏死因子(TNF)-α检测试剂盒、白细胞介素(IL)-6检测试剂盒、IL-1β检测试剂盒均购自北京莱宝公司。
1.2LPS诱导的心肌细胞损伤模型 参照庞斯斯〔13〕的方法进行改良,将心肌细胞H9c2用含10%胎牛血清的DMEM培养液,待细胞融合度达80%时,将含有LPS(100 ng/ml)的DMEM 培养液处理24 h。
1.3细胞转染 Control组:不做任何处理的H9c2细胞。LPS组:按照1.2方法处理的H9c2细胞。将pc-con、pc-H19、anti-miR-con、anti-miR-194-5p、pc-H19+miR-con、pc-H19+miR-194-5p按照脂质体LipofectamineTM2000转染至H9c2细胞,然后按照1.2方法进行处理,分别标记为pc-con组、pc-H19组、anti-miR-con组、anti-miR-194-5p组、pc-H19+miR-con组、pc-H19+miR-194-5p组。将上述各组细胞用于后续实验。
1.4qRT-PCR实验 取适量对数生长期1.3各组细胞,严格按照RNA抽提试剂盒说明书要求提取RNA,进行定量,然后按逆转录试剂盒说明书合成cDNA。最后按qRT-PCR试剂盒说明书进行miR-194-5p、LncRNA H19检测。用2-△△Ct计算miR-194-5p、LncRNA H19的表达。
1.5酶联免疫吸附试验(ELISA) 按照TNF-α、IL-6、IL-1β检测试剂盒说明书检测各组细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β含量。
1.6双荧光素酶报告基因检测实验 荧光素酶报告载体(psiCHECK2-H19-WT,psiCHECK2-H19-MUT)分别与miR-194-5pmimics、miR-NC用脂质体法转染24 h细胞,培养5 h后,更换新鲜培养液继续培养,转染48 h。按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书操作步骤进行操作。结果以海肾荧光素酶的发光强度与萤火虫荧光素酶发光强度的比值反映miR-194-5p与H19的结合力。
1.7统计学处理 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、t检验。
2.1LPS诱导心肌细胞中LncRNA H19和miR-194-5p的表达 与Control组(1.02±0.14、1.06±0.16)相比,LPS组心肌细胞中LncRNA H19表达(0.43±0.11)显著降低,miR-194-5p表达(2.58±0.22)显著升高(t=5.740、9.678,P=0.005、0.001)。
2.2LPS诱导心肌细胞炎症因子TNF-α、IL-6和 IL-1β的分泌 与Control组相比,LPS组心肌细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β表达均显著升高(均P<0.05),见表1。
2.3过表达LncRNA H19抑制LPS诱导心肌细胞炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌 与pc-con组相比,pc-H19组心肌细胞中LncRNA H19表达显著升高,TNF-α、IL-6、IL-1β表达均显著降低(均P<0.05),见表2。
2.4敲减miR-194-5p抑制LPS诱导心肌细胞炎症因子TNF-α、IL-6、 IL-1β的分泌 与anti-miR-con组相比,anti-miR-194-5p组心肌细胞中miR-194-5p、TNF-α、IL-6、IL-1β表达均显著降低(均P<0.05),见表3。
表1 LPS诱导心肌细胞炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌
表2 过表达LncRNA H19抑制LPS诱导心肌细胞炎症因子TNF-α、IL-6、 IL-1β的分泌
表3 敲减miR-194-5p抑制LPS诱导心肌细胞炎症因子TNF-α、IL-6、 IL-1β的分泌
2.5LncRNA H19靶向miR-194-5p 运用miRcode数据库预测到miR-194-5p与H19存在结合位点(图1);双荧光素酶活性检测结果显示,与miR-con组(0.98±0.09)相比,miR-194-5p组WT-H19细胞的荧光活性(0.31±0.04)显著降低;与pcDNA组(1.00±0.09)相比,pcDNA-H19组细胞中miR-194-5p表达(0.36±0.05)显著降低;与si-con组(0.94±0.11)相比,si-H19组(3.16±0.25)显著升高(均P<0.05),且4组差异有统计学意义(F=214.122,P=0.000)。
2.6过表达miR-194-5p逆转了过表达LncRNA H19对LPS诱导心肌细胞炎症因子TNF-α、IL-6、 IL-1β的抑制作用 与pc-con组(1.02±0.10)相比,pc-H19组心肌细胞中miR-194-5p表达(0.42±0.06)显著降低(P<0.05);与pc-H19+miR-con组相比,pc-H19+miR-194-5p组心肌细胞中miR-194-5p、TNF-α、IL-6、IL-1β表达均显著升高(均P<0.05)。
见表4。
图1 LncRNA H19中含有与miR-194-5p互补的核苷酸序列
表4 过表达miR-194-5p对LPS诱导心肌细胞炎症因子TNF-α、IL-6、 IL-1β的抑制作用
研究表明,LncRNA 可作为一种竞争性的内源性 RNA 与非编码miRNA交互作用,共同参与靶向基因的调控,对肿瘤发生与发展过程产生重要影响〔14,15〕。同时,miRNA通过大量蛋白质编码基因靶向调控LncRNA的表达,miRNA和LncRNA在调节细胞过程均有重要作用〔16〕。越来越多的证据表明,LncRNA和miRNA在心肌缺血和再灌注(I/R)损伤的发病机制中起重要作用〔17,18〕。Gong等〔17〕发现,缺氧诱导H9c2细胞活力、迁移和侵袭下降,细胞凋亡增加,H19上调,且敲低H19增加了H9c2细胞中的缺氧诱导的损伤,miR-139的表达与H19呈正相关,上调miR-139可加重缺氧诱导的损伤,另外,Sox8被鉴定为miR-139的靶标,其表达受miR-139的负调控,表明Sox8的过表达可能通过激活磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)来减少缺氧诱导的细胞损伤,提示H19通过miR-139介导的Sox8上调及PI3K/ AKT/ mTOR途径和MAPK的激活来减轻缺氧诱导的心肌细胞损伤。Luo等〔18〕研究发现,H19和miR-675在缺血再灌注的心肌细胞中上调,且敲除H19可增加细胞活力,减少细胞凋亡,减少炎症细胞因子(IL-1β、TNF-α 和IL-6),抑制氧化应激,下调p-IκB-α 和p-p65,并上调Nrf2和HO的表达,且miR-675的过表达可部分逆转这些作用,此外过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α 是miR-675的靶基因,且H19通过miR-675负调节PPARα表达,抑制PPARα、miR-675或H19可部分逆转对细胞功能(细胞凋亡、炎症和氧化应激)的抑制作用,另外,在心肌I/R小鼠模型中,H19的敲低可明显减少梗塞面积,增加左心室收缩压,并降低左心室舒张末期压力,表明抑制H19保护心脏免受心肌I/R损伤,其机制可能与调节miR-675/PPARα 通路有关。本研究发现,H19在损伤的H9c2细胞中低表达,且过表达H19可抑制H9c2细胞炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌,进一步深入研究发现,LncRNA H19靶向负调控miR-194-5p。
miRNA参与很多疾病的发生发展,如肺损伤、心脏损伤及各种癌症〔19〕。据调查miR-194-5p在肝癌、胃癌、肾癌、胶质瘤中均可发挥调控作用〔20~23〕。Xie等〔24〕报道,LPS处理的人成纤维细胞WI38可降低细胞活力,促进凋亡细胞,上调p-65、Bcl-3的表达,下调IκBα,且抑制miR-194可进一步增强LPS对细胞活力和细胞凋亡的影响,过表达miR-194可明显逆转LPS对细胞活力、细胞凋亡及关键蛋白p-65、Bcl-3、IκBα 的表达,揭示了miR-194通过抑制WI38细胞中核因子(NF)-κB途径增加了LPS诱导的细胞活力抑制和细胞凋亡增加。Zhai等〔25〕报道,miR-194在LPS诱导的H9c2心肌细胞损伤模型中表达异常升高,且miR-194可靶向负调控Slc7a5,过表达Slc7a5可逆转过表达miR-194对H9c2细胞的凋亡促进及激活Wnt/β-catenin通路作用,提示miR-194通过激活Wnt/β-catenin途径促进心肌细胞凋亡并参与内毒素血症诱导的心肌损伤。本研究发现,miR-194-5p表达异常升高,与Xie等〔24〕研究结果一致;深入研究发现,敲减miR-194-5p可抑制H9c2细胞炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌,过表达miR-194-5p可逆转过表达H19对LPS诱导心肌细胞炎症因子TNF-α、IL-6、 IL-1β的抑制作用。
综上,LncRNA H19可抑制LPS诱导的心肌细胞炎症因子的分泌,其机制可能与靶向负调控miR-194-5p有关,为心肌损伤的治疗提供理论依据。